馮驍 綜述，李琦涵 審校

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南 昆明650118

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由腸道病毒引起的傳染病，腸道病毒包括20 多種類型，其中柯薩奇病毒A16 型（Coxsackievirus type A 16，CA16）和腸道病毒71 型（enterovirus71，EV71）最常見。HFMD 可引起5 歲以下兒童的口腔疼痛、厭食、低熱及手、腳和口腔潰瘍，大多數(shù)兒童約1 周痊愈，但也可能導致少數(shù)兒童出現(xiàn)心肌炎、肺水腫、無菌腦膜炎等并發(fā)癥［1］，其中重癥病例可能出現(xiàn)病情的迅速發(fā)展，甚至導致死亡。HFMD 多次在全球范圍內(nèi)流行暴發(fā)，大多數(shù)由CA16 和EV71 引發(fā)，目前EV71滅活疫苗已上市［2-3］，但CA16 疫苗研究進展仍較緩慢。因此，CA16 感染機制的研究及CA16 疫苗的研發(fā)仍是目前解決該病公共衛(wèi)生問題的熱點和關鍵。CA16 疫苗的研發(fā)可充分借鑒EV71 疫苗的工藝、質(zhì)量控制及評價標準。目前，許多企業(yè)及機構開展了CA16 全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗、病毒樣顆粒樣（virus-like particle，VLP）疫苗的研發(fā)。本文就上述類型CA16 疫苗的研發(fā)進展作一綜述。

1 CA16 的病毒形態(tài)及基因結構特征

CA16 屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，病毒顆粒呈20 面體立體對稱的球形結構，直徑23～30 nm，由內(nèi)部核酸和衣殼蛋白質(zhì)組成，無脂質(zhì)包膜。其核酸為單股正鏈RNA，全長約7 410 個核苷酸。RNA兩端為5′和3′非編碼區(qū)，中間的開放閱讀框編碼1個多聚前體蛋白，經(jīng)蛋白酶水解為P1、P2 和P3 3 個前體蛋白，P1 可進一步酶解為VP1、VP2、VP3、VP4，共同組成病毒衣殼，VP1 含病毒主要的中和抗原決定簇［1］。

2 CA16 流行病學調(diào)查

2.1 C A 16 流行范圍 有研究顯示，CA16 的感染率高于EV71，CA16 引起的HFMD 流行在全球范圍內(nèi)均有報道。1994 年，英國暴發(fā)了嚴重的HFMD，此次導致流行的病原是CA16［4］；芬蘭暴發(fā)的HFMD的主要病原也是CA16［5］；日本監(jiān)測數(shù)據(jù)提示，CA16每3 年流行1 次［6］；在中國許多省份均有CA16 作為主要流行株引發(fā)HFMD 的報道，如上海、武漢等［7-9］。另外，由CA16 引發(fā)的重癥和死亡病例也在美洲和南亞［10］的許多地區(qū)有報道。

2.2 C A 16 的致病性 CA16 會引起5 歲以下嬰幼兒出現(xiàn)發(fā)熱、手足口皰疹和潰爛等，極少數(shù)重癥患兒也可出現(xiàn)肺炎、心肌炎、腦膜炎等致死病癥［11］。根據(jù)CA16 分子流行病學的調(diào)查研究顯示，CA16 基因組具有低保真復制和頻繁重組的特點，導致了CA16 具有高突變率的特性［12］。同時HFMD 流行病學提示，EV71 與CA16 常交替或共同流行［13］。這些證據(jù)均表明CA16 與EV71 將有較大幾率發(fā)生基因重組，且導致更為嚴重和復雜的HFMD。已上市的EV71 疫苗對CA16 無交叉保護作用，不能對由其他病原體引起的HFMD 起到預防保護作用［14］，因此研制有效的CA16 疫苗對HFMD 的防治將起到至關重要的作用，可擴大HFMD 的防治范圍。

3 CA16 疫苗研發(fā)的可行性

3.1 中和抗體對人群的保護效果 在對于CA16 流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，人感染CA16 后產(chǎn)生的中和抗體可保護人群避免二次感染［15］，提示CA16 的中和抗體可對其感染產(chǎn)生保護作用，這為CA16 疫苗的研發(fā)提供了可能和基礎。另外，有調(diào)查表明，新生嬰兒體內(nèi)的CA16 的抗體水平較高，但約9 月齡時開始減少，5 歲以上的幼童抗體水平又接近成人［16］，該結果符合HFMD 多發(fā)于9 月齡～5 歲嬰幼兒的特征，這也提示了人體內(nèi)相關中和抗體水平與HFMD 的發(fā)病率呈負相關，中和抗體可保護人體對抗HFMD。在以上流行病學調(diào)查基礎上，為驗證中和抗體的保護作用，多項研究進行了細胞水平和動物水平試驗，結果也證實了中和抗體具有保護作用［17-19］。這些均為CA16 疫苗的研發(fā)提供了基礎和可能。

3.2 EV 71 及其他腸道病毒疫苗的研發(fā)經(jīng)驗 目前已有腸道病毒疫苗（脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗，全病毒滅活EV71 疫苗等）成功上市，其中EV71 與CA16 的遺傳物質(zhì)有較高的同源性，同類腸道病毒的毒株篩選、制備工藝、質(zhì)控標準、動物模型的建立將為CA16疫苗的制備提供依據(jù)［20］。

4 CA16 疫苗相關的研發(fā)進展

4.1 免疫原性評價 免疫原性是抗原的一種特性，用疫苗模擬病原體接種機體后，抗原能刺激特定的免疫細胞，使免疫細胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應物質(zhì)抗體和致敏淋巴細胞，抗體和致敏淋巴細胞則直接抵御病原體的入侵。因此，免疫原性是評價疫苗有效性的重要指標。體液免疫和細胞免疫是構成適應性免疫反應的兩個方面，CD4+T 淋巴細胞具有激活B 淋巴細胞和CD8+T 淋巴細胞的功能。B 淋巴細胞主要產(chǎn)生中和抗體，中和抗體通過阻止病原體入侵宿主細胞而發(fā)揮體液免疫的作用；CD8+T 細胞通過靶向殺傷病原體入侵的宿主細胞而發(fā)揮細胞免疫的作用。當病原體再次入侵機體時，記憶B 細胞和記憶T 細胞迅速反應，保護機體不受感染和損傷［21］。且在中和抗體不足的情況下，機體主要靠細胞免疫發(fā)揮作用。因此，體液免疫和細胞免疫是免疫原性評價的指標，免疫原性的評價是通過對體液免疫和細胞免疫的評價來實現(xiàn)的。目前，評價免疫引起的病原體特異性細胞免疫反應多通過體外檢測脾細胞分泌細胞因子水平和淋巴細胞增殖反應［15］，評價免疫引起的病原體特異性體液免疫反應則是通過體外檢測血清中中和抗體的效價。

4.2 動物模型 由于EV71 和CA16 在基因組成和氨基酸序列上的高度同源性，可借鑒EV71 疫苗研制的流程和評價方法來研發(fā)CA16 疫苗。目前，EV71疫苗逐步在乳鼠模型、恒河猴模型中成功驗證了疫苗的有效保護性［22-23］，這些均推動了疫苗由實驗室試驗過度至臨床試驗，最后將成功上市。本課題組在前期研究中制備了相關實驗性CA16 疫苗，同時參考EV71 疫苗動物模型建立了CA16 疫苗有效性評價的小鼠模型，在此模型中驗證了CA16 疫苗的免疫原性和保護性；隨后，在小鼠模型成功的基礎上建立了恒河猴模型，模擬了人類感染CA16 病毒引起的典型的皰疹、病毒血癥和臨床狀態(tài)，并對恒河猴進行免疫后攻毒，結果顯示，制備的疫苗刺激猴機體可產(chǎn)生特異性免疫反應，但對猴機體未產(chǎn)生有效的保護作用，表明制備的CA16 疫苗可能不具有有效性［15］，此項研究為改進CA16 實驗性疫苗提供了依據(jù)。小鼠模型、猴體模型在CA16 疫苗研發(fā)中發(fā)揮了重要作用。

4.3 疫苗研發(fā)類型

4.3.1 全病毒滅活疫苗 傳統(tǒng)疫苗多為滅活疫苗，此類疫苗具有良好的保護效果，且安全性較高，因此在CA16 疫苗的研發(fā)過程中，許多研究均采用了抗原的滅活法制備疫苗。CAI 等［24］選用CA16 臨床分離株通過β 丙內(nèi)酯滅活后免疫小鼠，結果表明，其具有較好的免疫保護效果：分離得到的抗血清能在CA16-MAV 的致死性攻擊中保護新生小鼠；選用病毒株CA16-SZ05 和CA16-G08 制備滅活疫苗，分別免疫幼鼠和成年小鼠，可產(chǎn)生較好的交叉保護效果。該疫苗在幼鼠及成年小鼠體內(nèi)，對同源及非同源病毒均能有較好的防御作用。CHEN 等［25］用甲醛滅活CA16 臨床分離株免疫小鼠，也觀察到較好的免疫原性及保護作用。但YANG 等［26］用CA16 滅活疫苗對乳鼠和獼猴進行免疫試驗，誘導的中和抗體效價不高，在體內(nèi)存留時間較短。

4.3.2 減毒活疫苗 JIANG［27］對FY18、KMM ／ 08、KM208 株和臨床樣本分離獲得的7 株CA16 在KMB17 細胞中通過連續(xù)低溫傳代的方式進行減毒，經(jīng)以感染性滴度、抗原含量、致病性、免疫原性等為指標的篩選后，獲得KM168-8、KM154-6 兩株11 代次的減毒株，感染性滴度≥6.50 1gCCID50／ mL 時，對乳鼠不致病，無病理損傷，且單一穩(wěn)定；對乳鼠加強免疫后，抗體效價較高，抗體陽轉率達100%。因此，這些減毒株適宜進行后續(xù)的減毒疫苗開發(fā)。

4.3.3 亞單位疫苗 結構蛋白VP1 是CA16 中和抗原決定簇的主要集中部位，許多實驗室通過表達VP1 制備亞單位疫苗，這些研究的區(qū)別主要是其表達系統(tǒng)不同。YANG 等［28］采用CA16 青島株的VP1序列并利用原核表達技術在大腸埃希菌中表達了CA16 VP1 重組蛋白，經(jīng)純化后免疫小鼠，結果顯示，血清中和抗體效價均低于1 ∶8，不具有制備CA16 疫苗的潛力。LI 等［29］利用CA16 山東株的序列在Bacto-Bac 桿狀病毒Sf9 昆蟲細胞表達系統(tǒng)制備了VP1蛋白疫苗，免疫小鼠后，結果顯示該疫苗可誘導特異性細胞免疫和體液免疫。

4.3.4 DNA 疫苗 DNA 疫苗是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達質(zhì)粒直接注射至動物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達，研究可根據(jù)預期抗原表位設計重組表達質(zhì)粒，因此該類疫苗具備好的免疫原性和減毒的優(yōu)點，同時又無逆轉的風險，具有較大的應用潛力，視為繼傳統(tǒng)疫苗及基因工程亞單位疫苗后的第三代疫苗。TUNG 等［30］制備了EV71 DNA 疫苗，免疫小鼠后可產(chǎn)生血清特異性IgG 和中和抗體，同時，產(chǎn)生了細胞免疫應答，實驗也為CA16 DNA 疫苗的研發(fā)起到推動作用。LIU 等［31］在減毒傷寒沙門菌中成功構建了穩(wěn)定的重組質(zhì)粒VR-CVP1，其能在Vero細胞中成功表達出CVA16 VP1 蛋白，且在轉染的Vero 細胞中具有抗原活性。實驗提示，該蛋白可能會在動物體內(nèi)表達且具有免疫原性，為CA16 DNA 疫苗的研發(fā)提供了可能。與傳統(tǒng)的減毒或滅活疫苗相比，DNA 疫苗的研制周期更短，同時也降低了成本，且具備良好的免疫原性和減毒的優(yōu)點，無逆轉風險，因此DNA 疫苗將是未來疫苗發(fā)展的方向。

4.3.5 V LP 疫苗 VLP 疫苗也是研究的熱點之一。目前報道的CA16 VLP 疫苗由于同時表達結構蛋白P1 和酶蛋白3CD，均可通過3CD 切割P1 實現(xiàn)VLP自組裝，VLP 疫苗由于其表達系統(tǒng)不同而有許多種類。ZHAO 等［32］利用酵母表達系統(tǒng)表達的VLP 可刺激機體產(chǎn)生特異性中和抗體，具有良好的免疫原性。VLP 疫苗誘導的中和抗體滴度較其他疫苗高，對CA16 疫苗的開發(fā)有較大潛力。CHEN 等［33］對昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)進行密碼子優(yōu)化，針對P1 基因和3CD 基因，在桿狀病毒基因中插入啟動子P10 進行優(yōu)化。利用Bac-to-Bac 桿狀病毒系統(tǒng)表達CVA16 VLP，隨后免疫小鼠，可誘導高滴度中和抗體。另外，LYU 等［34］對釀酒酵母表達的EV71 VLP 進行晶體結構分析研究，通過在保留EV71 VLP 線性和構象中和表位的同時置換了VP1 GH 環(huán)上的4 個氨基酸，保證其特異性和增加其同源性，設計出EV71 ／ CA16嵌合VLP 新VLP 疫苗的制備思路。實驗結果證明，該嵌合VLP 可保護機體抵御兩種病毒的感染，為HFMD 疫苗的研發(fā)提供了新的方向和手段。

5 展 望

EV71 疫苗上市以來，已有效地降低了HFMD 重癥和死亡的發(fā)生率，但其缺乏交叉保護性，不能抵抗其他病原體引起的HMFD［35］。因此，研發(fā)CA16 疫苗將成為防治HFMD 的重點。CA16 中和抗體的保護作用為CA16 疫苗的研發(fā)提供了依據(jù)，該疫苗的研發(fā)可充分借鑒EV71 疫苗的工藝、質(zhì)量控制及評價標準。目前，多家企業(yè)及機構開展了CA16 全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗、VLP疫苗的研發(fā)。但CA16 病毒特性、流行特征、分子流行病學、血清流行病學、發(fā)病機制及保護機制等相關基礎研究，已成為CA16 疫苗研發(fā)中亟待解決的問題，需多部協(xié)作攻關，為疫苗研發(fā)提供理論基礎。另外，免疫原性和保護效果是疫苗有效性評價的關鍵指標，需開展相關評價方法和標準品研制及體內(nèi)外保護效果的平行性研究，建立標準化的評價平臺，確保疫苗有效性評價的特異性、可靠性和穩(wěn)定性。