李國(guó)秀，丁耀忠 綜述，劉磊，張杰 審校

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MDV）引起的一種烈性傳染病，主要感染牛、豬、綿羊、山羊等偶蹄動(dòng)物。FMDV 有7 種不同的血清型（O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2 和SAT 3），各血清型間無(wú)交叉反應(yīng)。FMD 雖死亡率較低，但給全球畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)將其列為一類傳染病。

病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）由病毒的衣殼蛋白組成，其缺乏病毒核酸而不具有傳染性，VLPs 形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒粒子類似，保留了天然病毒粒子的空間構(gòu)象。VLPs 疫苗能夠有效地誘導(dǎo)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的免疫反應(yīng)。目前，我國(guó)預(yù)防FMD 仍采用滅活疫苗，但滅活疫苗存在一定的局限性。因此，開發(fā)一種廉價(jià)的、非傳染性的亞單位或VLPs 疫苗尤為重要的。近年來(lái)，VLPs 還在納米生物技術(shù)中作為外源抗原載體或支架材料而得到廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者也開展了對(duì)FMDV VLPs 的研究，并取得一定的進(jìn)步。本文就FMDV 及其VLPs 疫苗的研究進(jìn)展作一綜述，為今后FMD 的防控提供參考。

1 FMDV 結(jié)構(gòu)蛋白

FMDV 粒子包含一個(gè)單鏈RNA 基因組，大小為8 400 bp，病毒粒子呈二十面體對(duì)稱，翻譯后加工成12 種蛋白質(zhì)（Lpro，VP1，VP2，VP3，VP4，2A，2B，2C，3A，3B，3Cpro，3D）［1］。FMDV 結(jié)構(gòu)蛋白由VP1、VP2、VP3 和VP4 共4 種衣殼蛋白各60 個(gè)拷貝組成，是P1衣殼前體多肽的裂解產(chǎn)物。在組裝過(guò)程中，5 個(gè)含有VP0、VP1 和VP3 拷貝的原基組裝成1 個(gè)五聚體，12個(gè)五聚體與1 個(gè)新轉(zhuǎn)錄的RNA 分子結(jié)合形成1 個(gè)病毒顆粒［2］。在RNA 存在下，VP0 最終成熟切割產(chǎn)生VP4 和VP2。VP1、VP2 和VP3 暴露于表面，VP1圍繞5 倍對(duì)稱軸，含有1 個(gè)G-H 環(huán)，其頂部有高度保守的RGD 氨基酸基序［3］，RGD 序列吸附至細(xì)胞表面并與表面受體結(jié)合，是病毒感染的關(guān)鍵。VP2 和VP3圍繞二十面體3 倍軸交替。VP4 在FMDV 血清型間高度保守，且VP4 和RNA 緊密結(jié)合，形成病毒粒子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。VP0、VP1、VP3、Lpro、2B、3A、3Cpro蛋白在抑制宿主先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用［4］。

2 FMDV 疫苗

2.1 傳統(tǒng)疫苗及其缺陷 FMD 是全球最主要的動(dòng)物疾病之一。在發(fā)展中國(guó)家，F(xiàn)MD 的控制和根除依賴于疫苗接種。20 世紀(jì)80 年代我國(guó)培育出溫度敏感毒株和O 型OP4 細(xì)胞培養(yǎng)弱毒疫苗［5］，由于技術(shù)的限制，導(dǎo)致毒株在模式動(dòng)物體內(nèi)馴化困難。同時(shí)RNA 病毒在宿主體內(nèi)極易由于基因突變導(dǎo)致毒株返強(qiáng)或毒株重組等情況。隨后，弱毒疫苗逐漸被滅活疫苗所取代，滅活疫苗在FMD 防控中占主導(dǎo)地位。我國(guó)滅活疫苗的發(fā)展經(jīng)歷了兩個(gè)技術(shù)階段，即轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)病毒抗原及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)病毒抗原［6］。歐洲和南美洲一些國(guó)家經(jīng)歷了10 多年滅活疫苗接種后，疫情得到了控制［7］。盡管滅活疫苗在當(dāng)前的FMD 控制方面取得了成功，但近年來(lái)其在緊急控制規(guī)劃應(yīng)用中也存在一些問(wèn)題和局限性，如疫苗生產(chǎn)過(guò)程中出現(xiàn)病毒逃逸及病毒滅活不完全等問(wèn)題，導(dǎo)致接種動(dòng)物感染FMDV［8］。因此，為避免傳統(tǒng)滅活疫苗所帶來(lái)的不足，迫切需要開發(fā)一種新型廉價(jià)的FMDV 疫苗，如重組亞單位疫苗、合成肽疫苗、VLPs 疫苗［9-11］。

2.2 FM D V V LPs疫苗 VLPs 通常是由病毒衣殼的一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的球形空腔結(jié)構(gòu)［12］，VLPs 安全性高、細(xì)胞攝取效率高，具有良好的溶解度與生物相容性及靶向給藥和載藥能力［13］，還可通過(guò)與天然病毒感染相似的途徑呈遞給樹突狀細(xì)胞，繼而有效地誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生體液與細(xì)胞免疫，因此，VLPs 被認(rèn)為是一種理想的生物載體。相關(guān)研究顯示，VLPs 自身具有佐劑分子的功能效應(yīng)，不需要與佐劑混合乳化就可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫刺激［14-15］。隨著研究的深入與技術(shù)的不斷進(jìn)步，基于VLPs 的應(yīng)用具有廣闊發(fā)展前景。目前，已構(gòu)建出多種病毒的VLPs，其中FMDV VLPs、乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）VLPs、豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）VLPs、牛細(xì)小病毒（bovine parvovirus，BPV）VLPs 和豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type2，PCV2）VLPs 已成功作為載體將FMDV 抗原表位嵌合在表面，并獲得了針對(duì)FMDV 的保護(hù)力。VLPs 既可與其他危害嚴(yán)重的傳染病一起制備成為多價(jià)苗，也可與同血清型病毒一起制備聯(lián)苗［16］。

3 FMDV VLPs 高效表達(dá)系統(tǒng)

3.1 原核表達(dá)系統(tǒng) VLPs 疫苗的開發(fā)嘗試了多種表達(dá)平臺(tái)，其中原核表達(dá)系統(tǒng)最常用的是大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)量大、產(chǎn)物易于純化、成本低廉、培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單、遺傳背景清晰，因此廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域［17］。重組FMDV VLPs 是由VP0、VP1 和VP3結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成，可通過(guò)3 個(gè)單獨(dú)結(jié)構(gòu)衣殼蛋白的共同表達(dá)或病毒衣殼前體P1-2A 與病毒蛋白酶3C 的共同表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)［18］。XIAO 等［19］開發(fā)了大腸埃希菌共表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過(guò)單個(gè)質(zhì)粒串聯(lián)驅(qū)動(dòng)FMDV 衣殼蛋白（VP0、VP1 和VP3）的表達(dá)，經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵獲得共表達(dá)的FMDV 衣殼蛋白，并在體外自組裝VLPs。研究結(jié)果表明，大腸埃希菌體外組裝VLPs可作為一種有效的FMD 疫苗候選方式。GUO 等［17］利用分子伴侶蛋白SUMO 對(duì)大腸埃希菌中FMDV的衣殼蛋白VP0、VP1 和VP3 進(jìn)行了高效表達(dá)，將融合蛋白中的相撲片段用SUMO 切割酶去除后，將3 種衣殼蛋白組裝成VLPs，大小和形狀與FMDV 顆粒相似，該VLPs 在豚鼠、豬和牛體內(nèi)均可產(chǎn)生較強(qiáng)的中和抗體。DONG 等［20］發(fā)現(xiàn)，用于疫苗VLPs 上顯示的表位肽EP141-160 具有較高的免疫活性，隨后，研究人員將反義RNA 與VLPs 結(jié)合，利用原核共表達(dá)系統(tǒng)制備FMDV 疫苗。結(jié)果表明，表位RNA VLPs可誘導(dǎo)小鼠對(duì)FMDV 產(chǎn)生免疫應(yīng)答。LEI 等［21］將3種FMDV 多表位抗原的分子內(nèi)佐劑與A 型和O 型FMDV 代表性毒株VP1 上的B 細(xì)胞表位或非結(jié)構(gòu)蛋白3A 上的T 細(xì)胞表位的編碼基因進(jìn)行串聯(lián)，并插入至截短型乙肝核心抗原的主要免疫原區(qū)進(jìn)行合成，在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得不同的重組抗原，并在體外高效自組裝成帶有FMDV 抗原表位的VLPs。PUCKETTE 等［22］將P1-2A 多聚蛋白和突變體3C（L127P）蛋白克隆至載體中，制備VLPs，突變體3C 蛋白酶L127P，顯著提高了重組FMDV 亞單位抗原的產(chǎn)量，L127P 突變代表FMD 疫苗生產(chǎn)的新進(jìn)展。

3.2 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)常用于表達(dá)FMDV VLPs，利用含桿狀病毒基因組作為重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Sf9 昆蟲細(xì)胞。真核表達(dá)系統(tǒng)有翻譯后加工修飾過(guò)程、表達(dá)量大，且具有良好的免疫原性［23］。LIU 等［24］利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了一種新型嵌合型VLPs，將O 型FMDV 的VP1基因嵌合至A 型P12A 基因中，形成嵌合基因，并利用A 型FMDV 蛋白酶3C 成功將其裂解，自組裝成VLPs。CHANG 等［25］通過(guò)篩選噬菌體展示文庫(kù)和融合表位肽的分析，鑒定出O 型和Asia1 型的表位8E8和3E11，利用桿狀病毒載體系統(tǒng)表達(dá)野生型BPV VP2 和8E8 表位嵌合VP2 蛋白，在Sf9 細(xì)胞中產(chǎn)生BPV VP2 蛋白，通過(guò)電鏡觀察到融合蛋白能夠組裝成VLPs，嵌合型VLPs 接種小鼠后均可產(chǎn)生抗BPV IgG 抗體與抗FMDV 中和抗體，其中抗FMDV 的中和抗體滴度最高為1 ∶176。因此，鑒定高度保守的中和表位有助于開發(fā)嵌合型FMDV 疫苗。另外，在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，pH 對(duì)VLPs 的組裝有一定影響，研究發(fā)現(xiàn)，O 型FMDV 衣殼比其他血清型對(duì)酸性敏感，在低pH 的昆蟲細(xì)胞中較難產(chǎn)生空的O 型VLPs［26］。

4 VLPs 疫苗的免疫效果

許多研究表明，F(xiàn)MDV VLPs 疫苗對(duì)動(dòng)物能夠產(chǎn)生較好的免疫效果，LIU 等［24］對(duì)組裝的嵌合型VLPs進(jìn)行了免疫原性和保護(hù)效果的評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，嵌合型VLPs 能引起明顯的體液和細(xì)胞免疫，接種嵌合VLPs 的5 只豚鼠中，有4 只完全獲得了FMDV 毒株O ／ MAY98 的50%豚鼠感染劑量（50% guinea pig infectious doses，GPID50）的保護(hù)，這些數(shù)據(jù)表明，嵌合型VLPs 是開發(fā)FMDV 新型疫苗的潛在候選者。GUO 等［17］利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備了VLPs，并作為免疫原用于豚鼠、豬和牛，研究結(jié)果顯示，F(xiàn)MDV 特異性中和抗體、T 淋巴細(xì)胞和IFNγ 被有效地誘導(dǎo)免疫動(dòng)物，F(xiàn)MDV VLPs 對(duì)牛的50%保護(hù)劑量（50%protection dose，PD50）可達(dá)6.34。上述研究結(jié)果表明，F(xiàn)MDV VLPs 疫苗具有良好的研發(fā)潛力。

5 小 結(jié)

FMD 給全球帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因FMDV 毒株易變異，使FMD 難以得到有效控制。隨著技術(shù)的進(jìn)步，新型疫苗的出現(xiàn)不僅克服了傳統(tǒng)疫苗的缺點(diǎn)，且在FMD 的防控上也取得了進(jìn)步。目前，雖然已有多種病毒的VLPs 在實(shí)驗(yàn)室中成功制備，但只有極少數(shù)在疫苗應(yīng)用中取得突破，獲得合適的組裝工藝、放大制備工藝和制劑工藝組合是阻礙其向前發(fā)展的重要原因。且由于VLPs 的特殊性，幾種表達(dá)系統(tǒng)組裝VLPs 的效率比較低、較難組裝，利用其制備和組裝結(jié)構(gòu)復(fù)雜的VLPs 仍存在諸多問(wèn)題。另外，選擇最佳的新型疫苗不僅需要評(píng)估其免疫原性，還需要評(píng)估其生產(chǎn)策略的可行性。因此，VLPs 作為FMDV抗原表位載體的疫苗還需要進(jìn)行更深入地探索和研究。