楊光，惠越，陳奎，王偉，饒楚炳

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北 十堰 442000； 2.十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是常見(jiàn)于老年人群體中的一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)而升高，主要的病理改變表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨缺損及軟骨下骨質(zhì)增生[1-2]。目前OA的發(fā)病機(jī)制依然不夠清楚，但氧化應(yīng)激、炎癥因子、維生素D、肥胖等因素都被證明是OA的危險(xiǎn)因素[3-4]，其中炎性因子誘發(fā)的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度降解和軟骨退化被認(rèn)為是OA的主要因素[5]。蒼術(shù)內(nèi)酯II(atractylenolide II，AT-II)是從中藥白術(shù)中分離的1種倍半萜烯，具有很好的抗炎、抗癌[6-8]及口服生物利用度，常用于治療黑色素瘤[9]。目前鮮有AT-II用于OA治療的相關(guān)研究。本研究通過(guò)木瓜蛋白酶制成OA大鼠模型，并用不同濃度AT-II處理3周后，觀察AT-II對(duì)各組大鼠軟骨損傷、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等過(guò)程的調(diào)控機(jī)制，以期為AT-II治療OA提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)8～10周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量260～280 g，購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2019-0004，飼養(yǎng)于十堰市人民醫(yī)院SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，許可證號(hào)：SYXK(鄂)2017-0098，培育室溫度20～25 ℃，濕度保持在65%～70%，進(jìn)行人工光照(12 h/晝、12 h/夜)。

1.2 藥品與試劑蒼術(shù)內(nèi)酯II(中國(guó)食品藥品檢定研究院，貨號(hào)180508)；兔抗MMP-13、Coll-II、Aggrecan、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、p-P65、P65、P-STAT3、STAT3、GAPDH多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：180622、180509、180429、180713、180613、180521、180729、180524、180603、180512、180719、180515)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(monochrome display adapter，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為：180118、180213、180321、180312)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)試劑盒(上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)分別為：170428、170524、170324、170329)；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，貨號(hào)分別為：ZP401、ZR102、ZF201)；MMP-13、Coll-II、Aggrecan及β-Actin引物由上海捷瑞公司合成。

1.3 儀器小動(dòng)物手術(shù)器械(北京眾實(shí)嘉合生物科技有限公司)；JT-P型石蠟包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；RM2235型病理切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；KD-P型組織攤片機(jī)(金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；Olympus型光學(xué)顯微鏡(上海普赫光電科技有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備及分組給藥構(gòu)建早期膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型[10]。將30只SD大鼠隨機(jī)分為5組，腹腔注射10%的水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉，在第1、3、5 天給其中4組大鼠左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.03 mol·L-1的L-半胱氨酸和5%(w/v)木瓜蛋白酶混合液，另外1組作為對(duì)照組注射等量生理鹽水，注射后傷口用碘伏消毒，之后放于籠中，自由活動(dòng)，密切關(guān)注傷口感染及其他并發(fā)癥情況。注射生理鹽水的大鼠作為對(duì)照組，其余4組分為模型組，AT-II(低、中、高劑量)組，各組大鼠均在造模后 48 h 開(kāi)始給藥。AT-II低、中、高劑量組分別進(jìn)行腹腔注射5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1的 AT-II 溶液，對(duì)照組和模型組腹腔注射同等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥3周，每天1次。

2.2 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 染色檢查大鼠軟骨損傷情況將大鼠麻醉于冰盒上取膝關(guān)節(jié)脛骨內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)后1/2處，用手術(shù)刀剪成0.5 cm×0.2 cm×0.5 cm的小骨塊，漂洗后用4%的多聚甲醛固定24 h，流水沖洗1 h用10%EDTA脫鈣液脫鈣2個(gè)月，行常規(guī)標(biāo)本脫水，浸蠟，包埋制成石蠟塊，連續(xù)切片為5 μm厚切片，進(jìn)行HE、番紅氧、Masson染色后，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察軟骨損傷情況。

2.2.2 qRT-PCR檢測(cè)按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上操作步驟提取各組大鼠軟骨組織中的總RNA，提取后用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)OD[(A260/A280)=1.8～2.0]值，并用凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 cDNA 的合成。反轉(zhuǎn)錄體系(10μL)：2×miRNA反應(yīng)混合液 5 μL，0.1%BSA 1 μL，miRNA PrimeScript?RT酶混合物1 μL，總RNA 0.5 μL，去RNA酶ddH2O 2.5 μL。反應(yīng)條件設(shè)置：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min。PCR體系10 μL：SYBR?Prmix Ex Tap II(2×)5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。詳細(xì)操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個(gè)樣孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的表達(dá)量。

2.2.3 Western blot檢測(cè)提取大鼠軟骨組織中的總蛋白，采用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛處理過(guò)預(yù)處理過(guò)的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人MMP-13、Coll-II、Aggrecan、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、P-P65、P65、P-STAT3、STAT3、GAPDH一抗(1500)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1500)孵育1 h，TBST漂洗 40 min，ECL發(fā)光液將PVD膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Image System軟件分析各組條帶灰度值，依據(jù)相對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2.4 血清中MDA、LDH、SOD、GSH水平的檢測(cè)取大鼠外周血，離心后取血清，檢測(cè)MDA、LDH、SOD、GSH水平。

2.2.5 血清中炎性細(xì)胞因子水平的檢測(cè)取大鼠外周血，離心后取血清，利用EILSA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-ɑ水平。

3 結(jié)果

3.1 AT-II改善模型大鼠軟骨損傷情況HE染色顯示，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨面骨裂隙形成，軟骨面破壞達(dá)到移行層、輻射層、鈣化層，且關(guān)節(jié)淺層表面逐漸缺失，深層細(xì)胞增生紊亂，用不同濃度AT-II處理后，關(guān)節(jié)軟骨表面逐漸變得光滑，細(xì)胞增生情況減少，細(xì)胞排列變得較為規(guī)整，且潮線破壞程度降低。番紅氧染色顯示，模型組大鼠軟骨出現(xiàn)大量的缺損及裂隙，細(xì)胞數(shù)減少，潮線消失，番紅氧染色重度或完全失染，AT-II低劑量組軟骨表面有裂隙生成，深達(dá)中間層，軟骨細(xì)胞增多，同源細(xì)胞群增多，番紅氧染色中重度失染，AT-II中劑量組軟骨表明裂隙較少，表面平整，番紅氧染色輕中度失染；AT-II高劑量組軟骨表明無(wú)明顯裂隙，表面平整，番紅氧染色均勻，無(wú)失染情況。Masson染色顯示，模型組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞滲出，軟骨細(xì)胞間隔增寬，AT-II處理后能夠顯著減緩模型引起的軟骨組織損傷，并減少了炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及紅細(xì)胞的滲出，軟骨細(xì)胞間的間隔變窄。見(jiàn)圖1。

圖1 HE、番紅氧、Masson染色觀察各組大鼠軟骨損傷情況

3.2 AT-II抑制OA大鼠軟骨組織細(xì)胞外基質(zhì)降解qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠軟骨組織中MMP-13mRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高，CollagenIImRNA、AggrecanmRNA相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.01)，與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠軟骨組織中MMP-13mRNA相對(duì)表達(dá)顯著降低，CollagenIImRNA、AggrecanmRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖2A。

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠軟骨組織中MMP-13蛋白表達(dá)顯著升高，Collagen II、Aggrecan蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠軟骨組織中MMP-13蛋白表達(dá)顯著降低，Collagen II、Aggrecan 蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖2B。

注：A：各組大鼠軟骨組織中MMP-13 mRNA、Collagen II mRNA、Aggrecan mRNA相對(duì)表達(dá)情況；B：各組大鼠軟骨組織中MMP-13、Collagen II、Aggrecan蛋白表達(dá)情況。與對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖2 AT-II對(duì)模型大鼠軟骨組織中MMP-13、Collagen II、Aggrecan表達(dá)的影響

3.3 AT-II抑制模型大鼠軟骨組織細(xì)胞凋亡Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠軟骨組織中Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠軟骨組織中Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05圖3 AT-II對(duì)大鼠軟骨組織中細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

3.4 AT-II降低模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)與對(duì)照組相比，模型組大鼠外周血中SOD、GSH水平顯著降低，MDA、LDH水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠外周血中SOD、GSH水平顯著升高，MDA、LDH水平顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖4 AT-II對(duì)大鼠血清中SOD、GSH、MDA、LDH水平的影響

3.5 AT-II降低模型大鼠炎癥反應(yīng)與對(duì)照組相比，模型組大鼠外周血中IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高，IL-10水平顯著降低(P<0.01)，與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠外周血中IL-6、IL-β、TNF-α水平顯著降低，IL-10水平顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖5 AT-II對(duì)大鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β水平的影響

3.6 AT-II抑制P65和STAT3蛋白磷酸化Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠軟骨組織中p-P65/P65、p-STAT3/STAT3水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠軟骨組織中P-P65/P65、P-STAT3/STAT3水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05圖6 AT-II對(duì)模型大鼠軟骨組織中P-P65/P65、P-STAT3/STAT3的影響

4 討論

現(xiàn)有研究表明，OA是在機(jī)械性及生物性因素的相互作用下，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨下骨降解及合成紊亂進(jìn)而引起的一種退行性疾病[11]。關(guān)節(jié)軟骨是由99%的軟骨基質(zhì)和1%的軟骨細(xì)胞組成的。因此，軟骨發(fā)揮正常的生理功能與其內(nèi)組分的形態(tài)及代謝穩(wěn)定關(guān)系密切[12]。Collagen II、Aggrecan是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分，當(dāng)軟骨組織遭受破壞時(shí)，會(huì)導(dǎo)致ECM異常降解，同時(shí)ECM的合成也減少，軟骨組織退化加重，從而導(dǎo)致OA的發(fā)生[13-14]。MMP-13作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，能顯著降解EMC中的Collagen II、Aggrecan[15]。本研究結(jié)果顯示，軟骨組織染色發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶處理大鼠后，軟骨細(xì)胞損傷嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞滲出，骨裂隙明顯，用不同濃度 AT-II 處理后發(fā)現(xiàn)軟骨組織的損傷得到了不同程度的改善，且改善程度呈AT-II濃度依賴(lài)；還發(fā)現(xiàn)模型組大鼠軟骨組織中Collagen II、Aggrecan表達(dá)明顯降低，MMP-13表達(dá)顯著升高，而不同濃度 AT-II 處理后，Collagen II、Aggrecan表達(dá)升高而MMP-13表達(dá)降低，表明AT-II處理能夠抑制軟骨組織EMC異常降解，促進(jìn)EMC組分的合成，進(jìn)而緩解OA的關(guān)節(jié)損傷。秦夢(mèng)等[16]研究結(jié)果表明，MMP-13表達(dá)下調(diào)、Collagen II表達(dá)上調(diào)是EMC降解破壞改善的表現(xiàn)，本研究與前人結(jié)果一致，表明AT-II能夠有效緩解EMC降解破壞引起的軟骨組織損傷。

近年來(lái)有研究者發(fā)現(xiàn)，OA的嚴(yán)重程度與軟骨組織細(xì)胞凋亡數(shù)量之間存在顯著的相關(guān)性[17]。Caspase-3、Caspase-9作為細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用的Caspase家族成員，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，其表達(dá)水平上調(diào)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。Bcl-2和Bax蛋白在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，兩者相互拮抗[19-20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠軟骨組織中Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)顯著降低，而不同濃度AT-II處理后，Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)顯著升高，表明AT-II處理后能夠顯著抑制軟骨組織中細(xì)胞凋亡，且濃度越高對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制越強(qiáng)烈。

目前研究表明，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)在OA的發(fā)生及發(fā)展中都發(fā)揮著非常重要的作用[21-22]。炎癥細(xì)胞因子除能夠影響軟骨細(xì)胞的相關(guān)代謝之外，還可通過(guò)逐級(jí)放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使軟骨細(xì)胞異常肥大，使軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌受到抑制，同時(shí)還會(huì)降解細(xì)胞外基質(zhì)[23-24]。IL-1β是最為常見(jiàn)的一種促炎癥因子，它除了自身可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)外，還可通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌NO、TNF-ɑ、IL-6等炎性因子，進(jìn)一步激活其他炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解[25]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)的活性氧物質(zhì)會(huì)在SOD、GSH等的作用下保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)SOD水平升高功能受到損傷時(shí)，ROS水平也升高，會(huì)攻擊線粒體DNA、酶、生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)，引起蛋白質(zhì)變性、基因突變及脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)及功能損傷[26]；MDA就是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物之一，其水平標(biāo)志著氧化應(yīng)激狀態(tài)[27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AT-II處理能提高模型大鼠血清中SOD、GSH、IL-10水平，降低MDA、LDH、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，表明 AT-II 處理能夠顯著改善模型大鼠的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

NF-κB信號(hào)通路途徑在機(jī)體內(nèi)炎癥、細(xì)胞凋亡、免疫等過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，很多藥物的抗炎作用都是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)完成的[28-29]。JAK2/STAT3信號(hào)通路途徑對(duì)多種疾病的發(fā)生發(fā)展都起到了重要的調(diào)控作用，STAT3的活化能夠有效控制炎癥反應(yīng)并修復(fù)氧化損傷[30]。本研究結(jié)果顯示，AT-II處理后，p-P65、p-STAT3蛋白表達(dá)降低，表明AT-II可能是通過(guò)抑制 NF-κB 和STAT3相關(guān)途徑來(lái)調(diào)控大鼠的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)過(guò)程。

綜上所述，AT-II可能是通過(guò)抑制NF-κB和STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡細(xì)胞表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞凋亡；同時(shí)促進(jìn)SOD、GSH的合成，恢復(fù)體內(nèi)氧化還原平衡，減少對(duì)脂膜的攻擊，降低氧化產(chǎn)物MDA、LDH的水平；提高抗炎癥細(xì)胞因子IL-10水平，降低促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的水平，緩解軟骨組織中的炎癥反應(yīng)，從而減輕大鼠軟骨損傷。本研究初步揭示了 AT-II 治療OA的相關(guān)機(jī)制，但還需要繼續(xù)深入研究，為AT-II臨床使用提供更有力的理論依據(jù)。