龐欣欣，石秀杰，張雅歌，韓佳瑞，孫新宇

1.河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

隨著我國(guó)糖尿病人數(shù)的逐年增多，糖尿病腎病已經(jīng)成為慢性腎臟病的首要病因，也成為糖尿病患者的主要死因之一[1-2]。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚缺乏有效的干預(yù)手段，中醫(yī)藥在糖尿病腎病的治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。不少經(jīng)驗(yàn)豐富的名老中醫(yī)藥專家對(duì)該病認(rèn)識(shí)深刻[3-4]，形成了一系列獨(dú)具特色的經(jīng)驗(yàn)方。不僅能改善糖尿病腎病患者的臨床癥狀，降低蛋白尿，改善腎功能等預(yù)后指標(biāo)，更能改善患者的生活質(zhì)量。

全國(guó)名中醫(yī)張炳厚教授為第二屆全國(guó)名中醫(yī)，第三屆首都國(guó)醫(yī)名師，全國(guó)首批中醫(yī)藥傳承博士后導(dǎo)師。從醫(yī)60余年，對(duì)糖尿病腎病具有獨(dú)到的見解。張老認(rèn)為本病基本病機(jī)在于“陰虛”和“血瘀”，治療應(yīng)注重養(yǎng)陰與活血。張老根據(jù)其經(jīng)驗(yàn)方“地龜湯類方”擬定了通絡(luò)地龜湯(TLDGD)，在臨床應(yīng)用取得了良好的效果，但其潛在的治療機(jī)制尚不完全清楚。

人類基因組中只有約1%的基因可以編碼為蛋白質(zhì)，在剩余的基因中，約占4%～9%的大于200 nt的非編碼轉(zhuǎn)錄本被定義為lncRNA[5]。既往認(rèn)為lncRNA不具有功能，而近年來(lái)不少研究證實(shí)了lncRNA具有強(qiáng)大的基因調(diào)控作用，與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也是包括中醫(yī)藥在內(nèi)的多種藥物治療疾病的重要靶點(diǎn)[6]。本研究擬通過腹腔注射鏈脲佐菌素制備I型糖尿病腎病模型，驗(yàn)證TLDGD對(duì)糖尿病腎病小鼠的治療作用，并通過觀察TLDGD對(duì)糖尿病小鼠治療前后長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)和信使RNA(mRNA)表達(dá)譜的影響，探討其潛在的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)6周齡雄性C57BL/6N小鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：No.11400700344642，體質(zhì)量(20±3)g。本研究所涉及的實(shí)驗(yàn)經(jīng)過河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并按照相關(guān)要求嚴(yán)格執(zhí)行(編號(hào)：KYLL20180925005)。

1.2 藥物及試劑TLDGD[熟地黃20 g，龜板30 g(先煎)，燙水蛭12 g，生黃芪20 g，當(dāng)歸30 g，酒大黃15 g，澤瀉10 g，甘草6 g]由我院制劑室提供，1 mL 相當(dāng)于1.43 g生藥。武火煎煮30 min，取藥液 200 mL；二次加水，二煎文火煎煮30 min，取藥汁200 mL；混合兩次藥液，共400 mL，煎煮至200 mL；再次濃縮，最后得藥液100 mL，4 ℃保存。鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：S0130)；Trizol試劑(上海荔達(dá)生物科技有限公司，批號(hào)：RNAA00250)；Agilent小鼠lncRNA 4x180K芯片(美國(guó)Agilent公司，批號(hào)：049801)。

1.3 儀器SIGMA3K 超速低溫離心機(jī)(美國(guó) SigmaAldrich)；NanoDrop ND-2000(美國(guó)Thero Scientific)、MUL-TISKAN FC型酶標(biāo)(美國(guó)Thermo Scientific)；Agilent Bioanalyzer 2100、Agilent Scanner G2505C(美國(guó)Agilent Technologies)；Veriti96 PCR儀(美國(guó)Thermo Elemental)；CFX96 熒光定量 PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司)；BS11OS精密電子天平(北京賽多利斯)(精確度 1/100 000)；穩(wěn)豪型血糖儀[強(qiáng)生(中國(guó))有限公司]。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立C57BL/6N雄性小鼠50只，自由攝食攝水，動(dòng)物室內(nèi)光照12 h晝夜循環(huán)，室溫22～25 ℃。適應(yīng)性喂養(yǎng)普通飼料1周，隨機(jī)選10只作為正常組，余40只作為模型組，予以高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食10 h后按50 mg·kg-1劑量腹腔注射STZ溶液(由pH 4.5檸檬酸鈉緩沖液配置)，連續(xù) 5 d，正常組普通飼料喂養(yǎng)及腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。1周后剪尾法測(cè)隨機(jī)血糖≥13.9 mmol·L-1為糖尿病模型成功[8]。

2.2 分組及給藥糖尿病模型小鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)8周，隨機(jī)分為DKD模型組、DKD+TLDGD組。藥物劑量換算參照劑量-體表面積換算法[7]，DKD+TLDGD組給予TLDGD(21.47 g·kg-1)灌胃，空白組及模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃，干預(yù)8周。

2.3 觀察項(xiàng)目及方法

2.3.1 空腹血糖及生化指標(biāo)檢測(cè)每2周檢測(cè)1次空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和24 h尿蛋白(24 h protein，24 hPro)，末次給藥后，禁食不禁水24 h，摘眼球取血，取腎臟，檢測(cè)血清中血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的水平。

2.3.2 腎臟組織病理學(xué)觀察取部分腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，脫蠟，水洗后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE染色)、碘酸雪夫氏(PAS)染色、Masson染色，光鏡下觀察各組腎臟組織的病理改變。

2.3.3 總RNA提取和質(zhì)量控制取小鼠腎組織各100 mg，樣品總RNA利用NanoDrop ND-2000定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100檢測(cè)RNA完整性。

2.3.4 RNA標(biāo)記和芯片雜交RNA質(zhì)檢合格后，樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程。首先，總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，再進(jìn)一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)標(biāo)記的cRNA。標(biāo)記好的cRNA和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C掃描得到原始圖像。由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行總RNA提取、芯片的雜交、數(shù)據(jù)讀取和生物信息學(xué)功能分析工作。

2.3.5 數(shù)據(jù)采集和處理采用Feature Extraction軟件(version10.7.1.1，Agilent Technologies)處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)。接著利用GeneSpring GX軟件(version 14.9，Agilent Technologies)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行quantile標(biāo)準(zhǔn)化。利用T檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行差異基因篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P≤0.05，同時(shí)對(duì)每組差異篩結(jié)果進(jìn)行散點(diǎn)圖，火山圖(對(duì)應(yīng)有生物學(xué)重復(fù)的分組)和聚類圖繪制。

2.3.6 生物信息學(xué)功能分析使用GeneSpring GXv12.1軟件對(duì)差異表達(dá)lncRNA靶基因進(jìn)行基因本體論(GO)富集分析，以了解基因參與的生物學(xué)過程。利用京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析，并利用超幾何分布算法計(jì)算每個(gè)Pathway中差異基因富集的顯著性。

3 結(jié)果

3.1 TLDGD對(duì)DKD小鼠腎功能、24 hPro及FBG的影響與正常組比較，DKD組Scr、BUN、24 hPro 和FBG均顯著升高(P<0.01)；與DKD組比較，DKD+TLDGD組小鼠Scr、BUN、24 hPro和FBG均顯著降低(P<0.01)。見圖1。

注：Ctrl：正常組，DKD：模型組，DKD+TLDGD：模型+TLDGD組。**與正常組相比，P<0.01，##與模型組相比，P<0.01圖1 TLDGD對(duì)各組小鼠血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、空腹血糖的影響

3.2 TLDGD對(duì)DKD小鼠腎臟病理的影響腎臟組織特殊染色顯示正常組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰、完整，DKD組腎小球體積增加，膠原沉積明顯，系膜基質(zhì)增生，系膜區(qū)變寬，毛細(xì)血管環(huán)增多，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，融合，壞死，DKD+TLDGD組以上病理?yè)p傷均得到明顯改善。見圖2。

圖2 TLDGD對(duì)各組小鼠腎臟組織病理形態(tài)的影響(×40)

3.3 lncRNA-mRNA芯片檢測(cè)TLDGD組和DKD小鼠腎組織之間的差異及分析

3.3.1 變異系數(shù)及檢出率根據(jù)芯片的探針重復(fù)分別計(jì)算質(zhì)控點(diǎn)和非質(zhì)控點(diǎn)的變異(CV)值，一般CV值要求低于15%。本次檢測(cè)結(jié)果中平均CV值為6.156 9，最大CV值為7.762 4，芯片實(shí)驗(yàn)成功。芯片的檢出率，主要統(tǒng)計(jì)的是每個(gè)樣本標(biāo)記為檢出的探針占總探針的比例。本次檢測(cè)結(jié)果中最低檢出率為57.87%，平均檢出率為 59.31%，最大檢出率為 61.85%。

3.3.2 散點(diǎn)圖和火山圖利用散點(diǎn)圖展示了328個(gè)差異基因與其他非差異基因的分布情況，火山圖顯示，TLDGD治療后，上調(diào)≥2倍的lncRNA有42個(gè)，下調(diào)≥2倍的有42個(gè)；上調(diào)≥2 倍的 mRNA 有132個(gè)，下調(diào)≥2倍的有57個(gè)。見圖3。

注：DKD：模型組，DKD+TLDGD：模型+TLDGD組；(A)lncRNA散點(diǎn)圖；(B)lncRNA火山圖；(C)mRNA散點(diǎn)；(D)mRNA火山圖。圖上的每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)基因，橫坐標(biāo)對(duì)應(yīng)DKD模型組的基因表達(dá)量，縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)TLDGD組的基因表達(dá)量。紅色對(duì)應(yīng)滿足對(duì)應(yīng)閾值的上調(diào)基因，藍(lán)色對(duì)應(yīng)滿足對(duì)應(yīng)閾值的下調(diào)基因，灰色為不滿足對(duì)應(yīng)閾值的基因圖3 TLDGD組與模型組比較差異表達(dá)的lncRNA 和 mRNA 的散點(diǎn)圖及火山圖

3.3.3 聚類圖對(duì)差異基因進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類，根據(jù)數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)特征進(jìn)行聚類，從而展示樣本之間、基因之間的聚類關(guān)系。見圖4。

注：A：lncRNA聚類；B：mRNA聚類。橫坐標(biāo)對(duì)應(yīng)DKD模型組的基因表達(dá)量，縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)TLDGD組的基因表量。紅色對(duì)應(yīng)高表達(dá)，藍(lán)色對(duì)應(yīng)低表達(dá)圖4 TLDGD組與模型組比較差異表達(dá)的lncRNA和mRNA聚類分析

3.3.4 lncRNA和mRNA芯片雜交取3個(gè)模型組腎組織和3個(gè)TLDGD治療組的腎組織，采用芯片雜交方法對(duì)差異表達(dá)的lncRNA 進(jìn)行篩選，篩選結(jié)果，差異表達(dá)的lncRNA共84 條，其中2 倍以上上調(diào)的有42條，下調(diào)的有42條；差異表達(dá)的 mRNA共189條，其中2 倍以上上調(diào)的有132條，下調(diào)的有57條；上調(diào)和下調(diào)最顯著的 lncRNA 和 mRNA 見表1，表2。

表1 TLDGD組與模型組比較，發(fā)生下調(diào)或上調(diào)的lncRNA (n=3)

表2 TLDGD組與模型組比較，發(fā)生下調(diào)或上調(diào)的mRNA (n=3)

3.3.5 lncRNA靶基因預(yù)測(cè)和生物信息學(xué)分析對(duì)每一個(gè)lncRNA共表達(dá)的差異基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA靶基因主要參與了炎癥中的細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附、免疫學(xué)過程等生物學(xué)過程。靶基因細(xì)胞組分分析顯示，靶基因可能主要來(lái)源于細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞膜和細(xì)胞外周。靶基因分子功能分析顯示，靶基因主要有肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、肝素結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、糖類結(jié)合等功能。見圖5。

圖5 lncRNA靶基因生物信息學(xué)分析

3.3.6 lncRNA靶基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析對(duì)于每一個(gè)lncRNA共表達(dá)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，分別篩選不同KEGG一級(jí)分類包括細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝、有機(jī)系統(tǒng)等的信號(hào)通路。靶基因主要和PI3K-Akt信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、黏著斑、RAS信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路等相關(guān)。見圖6。

圖6 lncRNA靶基因信號(hào)通路分析

4 討論

中醫(yī)藥治療糖尿病腎病歷史悠久，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，但仍存在中醫(yī)藥作用靶點(diǎn)、途徑機(jī)制不明等不足之處，因此需要進(jìn)一步探索其作用靶點(diǎn)及機(jī)制。隨著現(xiàn)代生命科學(xué)的飛速發(fā)展，基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)領(lǐng)域日新月異，已廣泛應(yīng)用于開展復(fù)方中藥治療疾病的分子機(jī)制研究[9-10]。

張炳厚教授在腎臟病的診治上積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了特有的補(bǔ)腎八法，特別是地龜湯類方治療腎虛諸病及各種慢性腎臟病，療效突出[11]。張老認(rèn)為，糖尿病腎病基本病機(jī)特點(diǎn)應(yīng)為“陰虛”與“瘀血”，且兩者在病程中呈動(dòng)態(tài)變化[12]，特別是疾病后期，瘀血重而陰虛輕，應(yīng)重在破血通絡(luò)，輔以滋補(bǔ)腎陰，故擬定TLDGD。我們課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，TLDGD能減少糖尿病腎病IV期患者的24 h蛋白尿、改善腎功能并顯著改善患者的中醫(yī)癥狀積分情況[13]，并可通過增強(qiáng)自噬改善DKD小鼠足細(xì)胞損傷[14]。本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TLDGD可以降低DKD小鼠Scr、BUN、24 hPro和FBG，并改善其腎臟病理?yè)p傷。因此，探索該方治療糖尿病腎病的分子機(jī)制意義重大。

隨著lncRNA近年來(lái)研究熱度不斷增加，越來(lái)越多的研究表明lncRNA與糖尿病腎病關(guān)系密切。lncRNA結(jié)構(gòu)與mRNA相似但不能編碼蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾等多個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)。Kato等報(bào)道lnc MGC在糖尿病腎病小鼠模型的腎小球中表達(dá)增加，參與糖尿病腎病的發(fā)病過程[15]。Li X等發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞模型中，lncRNA MALAT1可通過靶向miR-23c上調(diào)ELAVL1和NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生[16]，因此lncRNA可能是糖尿病腎病治療的重要靶點(diǎn)。lncRNA芯片技術(shù)能夠快速高通量的獲得與特定生物學(xué)過程或者疾病相關(guān)的lncRNA的表達(dá)變化，從而為后續(xù)的lncRNA功能研究或生物標(biāo)志物篩選提供極大的便利。如呂小萌等[17]通過lncRNA芯片技術(shù)對(duì)健康人、糖尿病患者、糖尿病腎病患者循環(huán)血液樣本進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)lncRNA-ARAP1-AS1/2在糖尿病和糖尿病腎病中異常表達(dá)，有望成為糖尿病和糖尿病腎病新的生物標(biāo)志物。但目前糖尿病腎病的lncRNA研究較少，尚處于起步階段。

本研究通過基因芯片技術(shù)篩選了TLDGD治療組和糖尿病模型組差異表達(dá)的lncRNA及mRNA。其中表達(dá)差異最明顯的lncRNA和mRNA分別是lncRNA dio3os和Npas2。Wang S等研究發(fā)現(xiàn)lncRNA dio3os可以作為炎癥性腸病的新型生物標(biāo)志物[18]；Cui K等發(fā)現(xiàn)lncRNA dio3os通過與miR-122相互作用，通過上調(diào)ALDOA促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[19]。但lncRNA dio3os在糖尿病腎病中未見文獻(xiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步驗(yàn)證研究。Npas2是最大的生物鐘基因，位于人類第2號(hào)染色體的p11.2短臂上，基因長(zhǎng)度約176.68 Kp[20]，Npas蛋白和BMAIL形成異源二聚體激活生物鐘基因PERs和CRYs的表達(dá)[21-22]，表達(dá)紊亂時(shí)會(huì)增加2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。Npas2參與新陳代謝的調(diào)控，敲除Npas2的小鼠脂肪酸代謝發(fā)生異常[23-24]。Jacovetti等[25]發(fā)現(xiàn)Npas2在大鼠胰島β細(xì)胞成熟過程中具有重要作用；Englund等[26]研究發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病對(duì)大鼠腎臟的Npas2表達(dá)節(jié)律出現(xiàn)明顯的提前，同時(shí)Npas2也可能是調(diào)節(jié)糖尿病大鼠自主活動(dòng)的潛在因子。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病小鼠經(jīng)過TLDGD治療后腎臟中顯著上調(diào)的Npas2能否作為糖尿病腎病潛在的靶點(diǎn)，仍須未來(lái)更深入的研究證實(shí)。

本研究進(jìn)一步對(duì)lncRNA靶基因鑒定及其功能富集分析，結(jié)果表明，其發(fā)揮作用的生物學(xué)過程主要包括炎癥中的細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附、免疫學(xué)過程；細(xì)胞組分分析顯示，靶基因可能主要來(lái)源于細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞膜和細(xì)胞外周；分子功能分析顯示，靶基因主要肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、肝素結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、糖類結(jié)合等功能。KEGG通路分析顯示，靶基因的功能主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、黏著斑、RAS信號(hào)通路、rap1信號(hào)通路等。

綜上所述，本研究采用基因芯片技術(shù)，在全基因組水平上成功篩選出了TLDGD干預(yù)糖尿病模型小鼠腎臟大量差異表達(dá)的lncRNA、mRNA，通過生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)并揭示了其關(guān)鍵的靶點(diǎn)和通路，以上工作將有助于為TLDGD治療糖尿病腎病提供新的思路。