杜兵強(qiáng)，張偉霞，張連平

鄭州市第六人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000

骨肉瘤是一種原發(fā)性骨腫瘤，青少年是其高發(fā)人群，發(fā)病率高，每萬人中有2～3例發(fā)病，由于其惡性程度高、復(fù)發(fā)率和病死率高，給患者帶來巨大威脅[1]。目前，手術(shù)輔助化療是骨肉瘤主要治療手段，患者預(yù)后保肢率及存活率均得到有效提高，但仍有部分患者治療效果不佳，出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[2]。因此，探索新的、有效治療骨肉瘤的藥物對(duì)改善患者預(yù)后、延長生存期有重要意義。隨著對(duì)惡性腫瘤研究的不斷深入，中藥在抗腫瘤及輔助治療腫瘤方面愈來愈受到人們重視。唇形科植物夏枯草最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清肝名目、消腫、軟堅(jiān)散結(jié)的功效[3]。關(guān)于其抗乳腺癌[4-5]、肝癌[6-7]效果已得到證實(shí)，但其對(duì)骨肉瘤的抑制作用鮮有研究。鑒于此，本研究通過建立骨肉瘤S180荷瘤小鼠，探討夏枯草是否能通過調(diào)控骨代謝經(jīng)典代謝通路OPG/RANK/RANKL發(fā)揮抑瘤作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞系60只SPF級(jí)健康昆明小鼠，雌雄各半，6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0004，飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗交替、23～25 ℃、濕度50%～60%的條件下，倫理學(xué)批號(hào)20200701；S180骨肉瘤細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，貨號(hào)：BS-C64870058。

1.2 藥物和試劑夏枯草干燥果穗購自長沙高橋藥材市場，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物植物研究所鑒定為唇形科夏枯草屬植物夏枯草(PrunellavulgarisL)，粉碎加入10倍蒸餾水，加熱回流提取4次，合并提取液并進(jìn)行減壓濃縮、冷凍干燥后備用。環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：160613)；吖啶橙溴乙錠(AO/EB)雙熒光染色試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，貨號(hào)：YM-S1403)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(蘇州宇恒生物科技有限公司，貨號(hào)：R2028)；BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Bio-rad公司，貨號(hào)：LIT33)；兔抗人OPG、RANK、RANKL抗體(美國Abcam公司，貨號(hào)分別為：ab73400、ab193713、ab216484)；二抗(美國Abcam，貨號(hào)：ab203061)。

1.3 儀器TCS SP8 X型激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；Synergy H4 Hybrid酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；9700實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；ChemiDoc XRS型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 骨肉瘤S180荷瘤小鼠模型建立及分組干預(yù)收集小鼠腹腔內(nèi)傳代6 d的S180腹水，生理鹽水洗滌、離心和重懸后，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107mL-1備用；所有小鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)取10只為對(duì)照組，剩余50只均于小鼠右側(cè)腋窩皮下接種 0.1 mL 的S180腹腔傳代細(xì)胞[8]，對(duì)照組接種 0.1 mL 生理鹽水，同條件繼續(xù)飼養(yǎng)，監(jiān)測腫瘤直徑至1 cm時(shí)，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組，即模型組、夏枯草低劑量組、夏枯草高劑量組、化療組、夏枯草聯(lián)合化療組，每組各10只。夏枯草低、高劑量組分別灌胃1 g·kg-1、2 g·kg-1的夏枯草生理鹽水，模型組和對(duì)照組灌胃生理鹽水；化療組腹腔注射 0.03 g·kg-1的環(huán)磷酰胺，隔日1次，夏枯草聯(lián)合化療組灌胃 2 g·kg-1的夏枯草生理鹽水加隔日腹腔注射0.03 g·kg-1的環(huán)磷酰胺，各組均干預(yù)14 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 小鼠生存狀態(tài)觀察及腫瘤大小測量給藥期間觀察各組小鼠生存狀態(tài)，于末次給藥2 h處死小鼠，迅速剝離瘤塊，去除雜質(zhì)，生理鹽水洗凈擦干，稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率。

2.2.2 各組腫瘤病理組織學(xué)變化取部分瘤組織，置于4%的多聚甲醛中固定，經(jīng)乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，制作厚度為4 μm的連續(xù)切片；切片經(jīng)脫蠟、水化，進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤病理變化。

2.2.3 各組腫瘤細(xì)胞凋亡率比較取部分瘤組織制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行吖啶橙溴乙錠(AO/EB)染色，熒光顯微鏡掃描拍照觀察：呈亮綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)均勻?yàn)檎＜?xì)胞；呈綠色熒光，細(xì)胞體積縮小或變性為早期凋亡細(xì)胞；呈淺黃色、棕色熒光，細(xì)胞形態(tài)改變?yōu)橥砥诘蛲黾?xì)胞；呈橘紅色固縮細(xì)胞為死細(xì)胞；每張照片隨機(jī)選取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)各種細(xì)胞數(shù)目。

2.2.4 OPG、RANK、RANKL基因表達(dá)檢測取部分瘤組織，加入液氮研磨，Trizol一步法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，酶標(biāo)儀測定RNA濃度和純度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)鏈cDNA；采用SYBR GREEN試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，按照說明書設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性 15 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸60 s，重復(fù)42個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，2-△△CT為待測基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，重復(fù)3次取Ct平均值，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.2.5 OPG、RANK、RANKL蛋白表達(dá)檢測取約75 mg部分瘤組織，液氮研磨，然后加入0.5 mL細(xì)胞裂解液，10 000 r·min-1離心5 min(離心半徑 12 cm)，收集上清進(jìn)行蛋白定量。取20 μg待測樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)1 h至硝酸纖維素膜，加入封閉液搖床孵育2 h，加入稀釋一抗，4 ℃搖床過夜，加入稀釋二抗，常溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光、顯影，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描各蛋白條帶灰度值，以待測蛋白與內(nèi)參灰度值比值作為相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況對(duì)照組小鼠均無異常，建模期間小鼠出現(xiàn)喜臥、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食量下降、毛色暗淡等現(xiàn)象，且隨著時(shí)間的延長逐漸加重；夏枯草組、化療組及夏枯草聯(lián)合化療組小鼠干預(yù)期間，上述一般狀況和精神狀態(tài)均有所好轉(zhuǎn)，其中夏枯草聯(lián)合化療組改善最為明顯，模型組情況更加嚴(yán)重，干預(yù)14 d內(nèi)各組均無死亡。

3.2 小鼠腫瘤組織的抑瘤率與模型組比較，其余4組瘤質(zhì)量均明顯減輕(P<0.05)；與夏枯草低劑量組比較，夏枯草高劑量組、化療組、夏枯草聯(lián)合化療組瘤質(zhì)量明顯減輕、抑瘤率明顯較高(P<0.05)；與夏枯草高劑量組比較，化療組瘤質(zhì)量、抑瘤率無明顯差異(P>0.05)，夏枯草聯(lián)合化療組瘤質(zhì)量明顯減輕、抑瘤率明顯較高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠抑瘤率比較

3.3 小鼠腫瘤的病理組織學(xué)模型組腫瘤細(xì)胞排列緊密、細(xì)胞核大而深染，細(xì)胞膜完整；夏枯草低劑量組細(xì)胞核染色稍淺，部分呈現(xiàn)細(xì)胞核分裂、空泡或細(xì)胞膜輪廓不清現(xiàn)象；夏枯草高劑量組和化療組上述狀況進(jìn)一步加重，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、胞漿增多現(xiàn)象，核分裂明顯，壞死區(qū)域擴(kuò)大；夏枯草聯(lián)合化療組呈現(xiàn)大面積淺色壞死區(qū)，僅有少量細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。見圖1。

注：A：模型組；B：夏枯草低劑量組；C：夏枯草高劑量組；D：化療組；E：夏枯草聯(lián)合化療組圖1 腫瘤病理組織學(xué)觀察(×200)

3.4 小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率與模型組比較，其余4組凋亡率均明顯升高(P<0.05)；與夏枯草低劑量組比較，夏枯草高劑量組、化療組、夏枯草聯(lián)合化療組凋亡率均明顯升高(P<0.05)；與夏枯草高劑量組比較，化療組無明顯差異(P>0.05)，夏枯草聯(lián)合化療組凋亡率均明顯升高(P<0.05)。見圖2,表3。

注：A：模型組；B：夏枯草低劑量組；C：夏枯草高劑量組；D：化療組；E：夏枯草聯(lián)合化療組圖2 腫瘤組織單細(xì)胞懸液激光共聚焦觀察

表3 小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率

3.5 小鼠腫瘤組織中OPGmRNA、RANKmRNA、RANKLmRNA的表達(dá)與模型組比較，其余4組RANKmRNA、RANKLmRNA表達(dá)量均明顯降低，OPGmRNA表達(dá)量及OPG/RANKL均明顯較高(P<0.05)；與夏枯草低劑量組比較，夏枯草高劑量組、化療組、夏枯草聯(lián)合化療組RANKmRNA、RANKLmRNA表達(dá)量均明顯降低，OPGmRNA表達(dá)量及OPG/RANKL均明顯升高(P<0.05)；與夏枯草高劑量組比較，化療組OPGmRNA、RANKmRNA、RANKLmRNA表達(dá)量及OPG/RANKL無明顯差異(P>0.05)，夏枯草聯(lián)合化療組RANKmRNA、RANKLmRNA表達(dá)量均明顯降低，OPGmRNA表達(dá)量及OPG/RANKL均明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組腫瘤組織中OPG mRNA、RANK mRNA、RANKL mRNA的表達(dá)

3.6 小鼠腫瘤組織中OPG、RANK、RANKL的蛋白表達(dá)與模型組比較，其余4組RANK、RANKL蛋白表達(dá)量均明顯降低，OPG蛋白表達(dá)量及OPG/RANK均明顯升高(P<0.05)；與夏枯草低劑量組比較，夏枯草高劑量組、化療組、夏枯草聯(lián)合化療組RANK、RANKL蛋白表達(dá)量均明顯降低，OPG蛋白表達(dá)量及OPG/RANKL均明顯升高(P<0.05)；與夏枯草高劑量組比較，化療組OPG、RANK、RANKL蛋白表達(dá)量及OPG/RANKL無明顯差異(P>0.05)，夏枯草聯(lián)合化療組RANK、RANKL蛋白表達(dá)量均較低，OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量及OPG/RANKL均明顯升高(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 小鼠腫瘤組織中OPG、RANK、RANKL的蛋白表達(dá)

圖3 Western blot圖

4 討論

骨肉瘤在原發(fā)性惡性腫瘤中發(fā)病率居首位，股骨、脛骨、肱骨及腓骨多見，其中病理分級(jí)較高可達(dá)88%，且約12%患者可出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移，早期診斷和治療至關(guān)重要[9-11]。骨肉瘤病因目前仍未明確，且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及黏附分子、基因突變、免疫狀況和凋亡等[12]。與其他惡性腫瘤相比，骨肉瘤的典型特征為腫瘤細(xì)胞具有成骨性，但其確切的成骨機(jī)制仍需進(jìn)一步探討[13]。常規(guī)化療有助于改善患者癥狀，但仍有較高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，5年生存率不足70%[14]。研究發(fā)現(xiàn)[15]，化療藥物抗藥性、不良反應(yīng)和肺轉(zhuǎn)移是影響骨肉瘤轉(zhuǎn)歸的重要原因，尋找新的靶點(diǎn)治療藥物對(duì)改善骨肉瘤預(yù)后有重要意義。近年來，中藥在抗腫瘤方面逐漸受到關(guān)注，我國中藥資源豐富，尋找抗骨肉瘤中藥有明顯優(yōu)勢[16-17]。

夏枯草主要藥物部位為其干燥果穗，中醫(yī)用于治療目赤膿腫、乳癰腫痛、頭暈?zāi)垦５取，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，夏枯草對(duì)淋巴結(jié)核、高血壓、甲狀腺炎等均有較好治療效果[18-20]。夏枯草含有多種活性成分，如三萜類、黃酮類、多糖類、有機(jī)酸等[21]，此類化合物均具有顯著抗腫瘤作用。周亞敏等[22]分析夏枯草化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)，從中分離的12種活性化合物中有5種均具有明顯抑制乳腺癌細(xì)胞生長的作用。韋云妮等[23]體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，夏枯草對(duì)非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠瘤體具有顯著抑制作用，其中2.4 g·kg-1劑量的夏枯草效果最佳。本研究中各藥物干預(yù)期間一般狀況及精神狀態(tài)均有所好轉(zhuǎn)，腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞壞死逐漸加重，其中夏枯草聯(lián)合化療組一般狀況的改善和腫瘤組織病理學(xué)變化最為明顯。與模型組比較，其余4組瘤質(zhì)量均明顯減輕，抑瘤率和凋亡率均明顯升高，其中夏枯草低劑量組變化稍明顯，高劑量組和化療組其次，聯(lián)合化療組變化最為明顯，提示夏枯草對(duì)S180骨肉瘤小鼠有顯著抑制作用，且具有增強(qiáng)化療效果的作用。

骨是機(jī)體代謝十分活躍的器官，骨吸收和骨合成在整個(gè)生命進(jìn)程不斷的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，OPG/RANK/RANKL在骨代謝中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，其相關(guān)活性因子間的平衡狀態(tài)維持骨正常代謝狀態(tài)，一旦失衡可導(dǎo)致骨肉瘤、骨質(zhì)疏松癥等骨疾病[24-25]。RANK是一種跨膜蛋白，屬于NF-κB受體活化因子，是誘導(dǎo)下游c-Jun氨基酸激酶和NF-κB活化的關(guān)鍵因子，當(dāng)RANK與位于細(xì)胞表面的配體RANKL結(jié)合后，可激活破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路，參與骨吸收[26-28]。腫瘤壞死因子受體家族成員OPG屬于骨保護(hù)蛋白，可競爭性結(jié)合RANKL，兩者結(jié)合可抑制破骨細(xì)胞分化信號(hào)傳遞，發(fā)揮抑制骨吸收的作用，同時(shí)參與調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞凋亡[29-31]。維持OPG-RANK-RANKL系統(tǒng)間的平衡狀態(tài)對(duì)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡十分重要。本研究應(yīng)用不同劑量夏枯草及夏枯草聯(lián)合化療方法干預(yù)骨肉瘤小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，其余4組腫瘤組織中RANK、RANKL的基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，OPG 的基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量及OPG/RANKL均明顯升高，且聯(lián)合化療組變化最為明顯，提示夏枯草抑制S180骨肉瘤的作用可能機(jī)制為通過下調(diào)RANK、RANKL表達(dá)，上調(diào)OPG表達(dá)及OPG/RANKL的值，從而抑制骨肉瘤增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，夏枯草對(duì)S180骨肉瘤小鼠有顯著抑制作用，且具有增強(qiáng)化療效果的作用，可能通過下調(diào)OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路中RANK、RANKL表達(dá)，上調(diào)OPG表達(dá)及OPG/RANKL發(fā)揮作用，為夏枯草相關(guān)抗癌藥物的研發(fā)提供理論參考。