王小雙，魏文峰，霍金海，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所·黑龍江 哈爾濱 150036)

橘皮竹茹湯出自于東漢末年張仲景《金匱要略·嘔吐下利病脈證治》，由陳皮、竹茹、生姜、大棗、人參、甘草6味藥組成，是現(xiàn)在臨床治療胃虛有熱之嘔逆的代表方劑。大量臨床研究證實(shí)，橘皮竹茹湯治療胃食管反流病具有良好的療效[1-3]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)性、整體性的研究理念與中藥復(fù)方多組分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用等特點(diǎn)不謀而合，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)中藥單味藥、藥對(duì)、復(fù)方治療抑郁癥、癌癥、骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病進(jìn)行研究[4-6]。本文以橘皮竹茹湯治療胃食管反流病為研究對(duì)象，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法通過(guò)構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)，為深入探討橘皮竹茹湯治療胃食管反流病的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 橘皮竹茹湯化學(xué)成分的整理與篩選 本課題組通過(guò)采用超高效液相色譜儀聯(lián)用四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)對(duì)橘皮竹茹湯的化學(xué)物質(zhì)成分進(jìn)行鑒別，共鑒別出化學(xué)物質(zhì)成分141種。參照實(shí)驗(yàn)室前期體外化學(xué)成分的分析數(shù)據(jù)，整理每個(gè)化學(xué)成分的CAS號(hào)、Chamical name、InChIKey，建立橘皮竹茹湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。利用TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)平臺(tái)，得出每一化合物的ADME性質(zhì)，選擇同時(shí)滿足 OB≥30%、DL≥0.18 的化學(xué)成分作為候選的活性成分。

1.2 成分作用靶點(diǎn)的獲取 經(jīng)過(guò)篩選的活性成分通過(guò)ChemDraw Ultra 12.0 軟件繪制結(jié)構(gòu)圖，并以SDF 格式保存。分別上傳至PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)服務(wù)器，獲得虛擬篩選結(jié)果(前300個(gè)靶點(diǎn))。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http: / /www.Uniprot.org /)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到化合物對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因號(hào)。

1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)Drugbank(https://www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)，以gastroesophageal reflux disease(GERD)、reflux esophagitis為檢索詞，獲取FDA 批準(zhǔn)的小分子治療胃食管反流病相關(guān)藥物靶點(diǎn)。上述檢索詞通過(guò)DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)分別檢索 2 大數(shù)據(jù)庫(kù)中與胃食管反流病相關(guān)的靶基因。最后使用Bioinformatics平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)將橘皮竹茹湯有效成分的靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行擬合篩選，繪制venn圖獲得橘皮竹茹湯具有治療胃食管反流病的作用靶點(diǎn)。

1.4 橘皮竹茹湯成分-胃食管反流靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將橘皮竹茹湯成分與胃食管反流交集靶點(diǎn)提交至 STRING11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型(PPI)，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9)，其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)CytoScape3.6.1中MCODE插件識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)在module，得到潛在蛋白質(zhì)功能模塊。

1.5 生物功能和通路分析 將篩選得到的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)， 對(duì)橘皮竹茹湯作用靶點(diǎn)進(jìn)行 GO(gene ontology)富集分析以及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路富集分析。設(shè)定閾值P<0.05并按照涉及的靶點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行排序，篩選排名靠前的生物過(guò)程和通路，并對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6 橘皮竹茹湯處方組成-活性成分-胃食管反流靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 運(yùn)用 CytoScape3.6.1 構(gòu)建橘皮竹茹湯中藥-活性成分-胃食管反流靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用 CytoScape3.6.1 內(nèi)置工具分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度(Degree)、介度(BetweennessCentrality)及緊密度(ClosenessCentrality)等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結(jié)果

2.1 橘皮竹茹湯活性成分 前期本課題組利用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)鑒別體外成分141個(gè)，通過(guò)TCSMP數(shù)據(jù)庫(kù)查找每個(gè)成分的OB和DL值，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)的方法設(shè)置 OB≥30% 和 DL≥0.18，通過(guò)OB與DL的篩選得到橘皮竹茹湯的活性成分24個(gè)，見(jiàn)表1。其中陳皮成分3個(gè)，甘草成分17個(gè)，竹茹成分1個(gè)，人參成分2個(gè)，生姜成分2個(gè)，大棗成分3個(gè)，竹茹和人參共有成分1個(gè)(beta-sitosterol)，甘草和生姜共有成分1個(gè)(sitosterol)，甘草和大棗共有成分2個(gè)(Mairin、quercetin)。

表1 橘皮竹茹湯中篩選的24個(gè)成分信息

2.2 橘皮竹茹湯中治療胃食管反流病活性成分潛在靶蛋白信息 將上述24個(gè)橘皮竹茹湯活性成分通過(guò) Pharm-Mapper分析平臺(tái)進(jìn)行反向分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)出24個(gè)化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)。將所有靶點(diǎn)名稱校正為該靶點(diǎn)的基因名稱，共得到421個(gè)基因靶點(diǎn)。將DrugBank，GeneCards 和 DisGeNET 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的靶點(diǎn)取交集即確定為胃食管反流病相關(guān)靶點(diǎn)，共得到251個(gè)胃食管反流病靶點(diǎn)。通過(guò)韋恩圖找出橘皮竹茹湯和胃食管反流病共同靶基因，共24個(gè)，見(jiàn)圖 1。

圖1 疾病靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)的匹配

2.3 橘皮竹茹湯成分-胃食管反流靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將橘皮竹茹湯和胃食管反流病交集靶點(diǎn)提交至STRING11.0平臺(tái)，得到橘皮竹茹湯靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2(A)。得到PPI網(wǎng)絡(luò)后，運(yùn)Cytoscape3.6.1中的MCODE插件對(duì)蛋白相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，得到module，見(jiàn)圖2(B)。

圖2 橘皮竹茹湯-胃食管反流靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)與module

2.4 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 為系統(tǒng)地闡明橘皮竹茹湯治療胃食管反流病的多種作用機(jī)制，從生物學(xué)過(guò)程，分子功能和細(xì)胞成分3 個(gè)方面對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行了GO富集分析，同時(shí)進(jìn)行KEGG分析得到43條通路，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，與橘皮竹茹湯靶點(diǎn)密切相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)負(fù)調(diào)控、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖正調(diào)控和MAPK梯級(jí)等；分子功能：鈣離子結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性和內(nèi)肽酶活性等；細(xì)胞組分：質(zhì)膜、胞漿、和胞外區(qū)等。這表明橘皮竹茹湯可能通過(guò)參與上述生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分而起作用。KEGG分析結(jié)果顯示，主要涉及MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、FOXo信號(hào)通路和Rap1信號(hào)通路等。將KEGG通路中去除廣泛信號(hào)通路，然后將富集基因數(shù)目較多的信號(hào)通路合并，見(jiàn)表2。

表2 橘皮竹茹湯作用靶點(diǎn)KEGG信號(hào)通路

圖3 橘皮竹茹湯作用靶點(diǎn)富集分析結(jié)果

2.5 中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用 Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建橘皮竹茹湯中藥-活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，如圖 4 所示。通過(guò) CytoScape3.6.1 內(nèi)置的Network Analyzer分析橘皮竹茹湯治療胃食管反流網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，可得到主要活性成分及核心靶點(diǎn)。

結(jié)果表明，白樺脂酸連接度(degree)為20，介度(Betweenness Centrality)為，0.0238，緊密度 (Closeness Centrality)為0.5431，預(yù)測(cè)白樺脂酸為橘皮竹茹湯治療胃食管反流主要成分，其次植物甾醇(連接度：20介度：0.0011緊密度：0.5431)、β-谷甾醇(連接度：19介度：0.0619緊密度：0.5338)、黃柏酮(連接度：19介度：0.0297緊密度：0.5338)，見(jiàn)表3。

表3 橘皮竹茹湯主要活性成分網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

EGFR連接度為29，介度為0.0345，緊密度為0.6176，認(rèn)為EGFR是橘皮竹茹湯治療胃食管反流最主要的靶點(diǎn)，同時(shí)MAP2K1、HRAS、BRAF、ACE、ESR1、HDAC8、IGF1R是相對(duì)重要靶點(diǎn)。

■處方組成 ；●活性成分；◆作用靶點(diǎn)；富集通路圖4 橘皮竹茹湯中藥-活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究通過(guò)前期的體外成分分析及TCSMP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)按OD≥0.18，OB≥30%條件篩選出橘皮竹茹湯24個(gè)潛在活性成分，構(gòu)建了中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，分析橘皮竹茹湯活性成分、靶點(diǎn)及疾病的相互作用關(guān)系。橘皮竹茹湯治療胃食管反流病作用靶點(diǎn)24個(gè)。其中，細(xì)胞色素P450單加氧酶(CYP2C8、CYP2C9)是一類可以參與各種內(nèi)源性底物代謝的蛋白，包括脂肪酸、類固醇激素和維生素等[7]，而同樣是細(xì)胞色素P450家族的CYP2C19已有研究表明[8]，其基因的多態(tài)性對(duì)質(zhì)子泵抑制劑代謝有直接影響，從而影響GERD的治療效果，這提示我們橘皮竹茹湯可能作用于CYP2C8、CYP2C9靶點(diǎn)同樣可以影響質(zhì)子泵抑制劑代謝，從而達(dá)到治療GERD的效果。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與EGFR相關(guān)的疾病包括炎癥性皮膚和腸道疾病等。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)[9]，病變胃黏膜組織中EGFR的蛋白表達(dá)量高于非病變胃黏膜組織，猜測(cè)橘皮竹茹湯可能是通過(guò)抑制EGFR表達(dá)達(dá)到治療目的。橘皮竹茹湯活性成分通過(guò)上述靶點(diǎn)相互作用，來(lái)達(dá)到“降逆止嘔，益氣清熱”的作用。

KEGG分析結(jié)果顯示，主要涉及MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、FOXo信號(hào)通路和Rap1信號(hào)通路等。Rap1是一種小分子G蛋白，表現(xiàn)為有活性和無(wú)活性結(jié)合形式兩種構(gòu)象，它通過(guò)不同效應(yīng)子抑制或激活ERK通路[10]。ERK也稱絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，是一種小分子G蛋白酶，在細(xì)胞對(duì)各種應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡[11]。其信號(hào)通路主要由3個(gè)亞族組成，分別是：ERK亞族、JNK亞族、P38亞族[12]。Souza RF等發(fā)現(xiàn)GERD患者與正常人在食管鱗狀細(xì)胞的ERK1/2-MAPK表達(dá)存在顯著差異[13]。胃酸反流可能激活正常食管鱗狀細(xì)胞的ERK1/2，從而增加其增殖并阻止向腸型細(xì)胞分化。同時(shí)有研究表明，GERD患者胃黏膜內(nèi)IL-8表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常人[14-16]，而正常人食管上皮細(xì)胞受到胰蛋白酶刺激的同時(shí)加入MAPK抑制劑和ERK抑制劑可以降低IL-8炎癥趨化因子的mRNA及蛋白表達(dá)[17]，進(jìn)而恢復(fù)胃黏膜功能。橘皮竹茹湯可能通過(guò)該通路抑制IL-8因子表達(dá)和阻止食管鱗狀細(xì)胞增殖與分化，從而治療胃食管反流病。

FoxO是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等細(xì)胞過(guò)程[18]。FoxO家族主要受PI3K-Akt通路調(diào)控[19-20]，通過(guò)磷酸化/去磷酸化改變FoxO4的亞細(xì)胞定位[21]，而FoxO4轉(zhuǎn)錄因子在人類胃腸道的粘膜層腺體細(xì)胞胞漿進(jìn)行表達(dá)[22]。同時(shí)，F(xiàn)oxO可以抑制NF-KB轉(zhuǎn)錄因子的活化[23-24]，NF-KB是一種參與許多炎癥因子表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子[25]。有研究表明，胃食管反流通過(guò)NFKB介導(dǎo)的炎癥破壞食管粘膜屏障功能[26]，而FoxO4通過(guò)作用于NF-KB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)炎癥因子有抑制作用，從而對(duì)組織的炎癥有保護(hù)作用[27]。橘皮竹茹湯可能通過(guò)該通路抑制炎癥因子的表達(dá)，在胃食管反流病的炎癥免疫和發(fā)生過(guò)程方面起重要作用。

PI3K/AKT 是細(xì)胞生存中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡和腫瘤發(fā)生有重要作用[28]。金立鵬[29]利用HCl構(gòu)建食道鱗狀細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)ERK和AKT/PI3K 信號(hào)通路的活性能夠減輕HCl 誘導(dǎo)帶來(lái)的細(xì)胞損傷。同時(shí)在食管相關(guān)疾病中也發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá)異常[30]。表明PI3K/AKT信號(hào)通路與食管相關(guān)疾病密切相關(guān)。

綜上所述，橘皮竹茹湯治療胃食管反流病具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路特點(diǎn)，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析平臺(tái)對(duì)橘皮竹茹湯中六味中藥成分靶點(diǎn)及胃食管反流病疾病靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)后續(xù)橘皮竹茹湯治療胃食管反流病作用機(jī)制的研究提供參考。