呂 琦劉明婭戚菲菲龔姝然周沙沙鮑琳琳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,北京 100021)

目前,新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情全球流行,由于該病病原體新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳染性強,傳播迅速,截至2020 年9 月全球累計確診人數(shù)超過2500 萬例,死亡人數(shù)超過85 萬,新型冠狀病毒肺炎對人類健康造成巨大威脅。SARSCoV-2 病毒主要通過飛沫傳播和密切接觸傳播[1-3],所以病毒在環(huán)境中的穩(wěn)定性和在物體表面的活性直接影響了病毒傳播的效能,這些數(shù)據(jù)的掌握對制定有效的新冠病毒疫情控制措施極為重要。疫情爆發(fā)初始,以及國內(nèi)疫情有效控制后,局部地區(qū)出現(xiàn)感染事件,似乎都圍繞著海鮮產(chǎn)品而發(fā)生,推測由于海鮮產(chǎn)品在包裝、運輸過程中,新冠病毒污染了裝運的外環(huán)境,并具有低溫冷藏環(huán)境下長時間存活的能力,這些條件的共存使得病毒容易向外傳播或擴散,導(dǎo)致到貨地區(qū)和人員的污染和感染。

為準確評估新冠病毒潛在風險及為疫情防控、病毒檢疫提供科學(xué)依據(jù),本研究選擇海鮮產(chǎn)品三文魚,配制4% NaCl 仿海鹽水來簡單模擬海水主要成分(海水平均鹽度為35‰)[4]。將病毒滴加在三文魚表面和4%仿海鹽水中,分別放置在不同溫度條件,不同時間測定病毒滴度評估病毒在三文魚及仿海鹽水中的存活情況。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞

VeroE6 細胞,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所病原中心保存。

1.1.2 病毒株

SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN(GenBank:MT093631.2),由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心分離。

1.2 主要試劑與儀器

三文魚塊:采購于食品生鮮超市;胎牛血清(Gibco,12109290CP);青/鏈霉素(Penicillin/Streptomycin) 雙抗生素溶液(Gibco,2076677);DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone,AE29431646);0.25%Trypsin-EDTA(Gibco,2085264)。

生物安全柜(Thermo,1287,美國);二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo,371,美國);-80℃超低溫冰箱(Thermo,905,美國);15 mL、50 mL 管離心機(SIGMA,6K15,美國);1 mL 管臺式離心機(KUBOTA,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 病毒在三文魚表面活性的測定

實驗分設(shè)2 組,22℃組(室溫)和4℃組,每組各6 塊三文魚塊(長寬高為4 cm×4 cm×1 cm)。取100 μL 106.5TCID50/mL 病毒液加至各組受試魚塊表面,分別在22℃(室溫)和4℃放置0 h、1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d 后,利用2 mL DMEM 培養(yǎng)基(100 U/mL 青霉素和100 μg/mL)反復(fù)沖洗三文魚表面3～5次,沖洗液離心收集上清液,測定滴度。實驗中除溫度外,環(huán)境濕度和風速基本一致,實驗重復(fù)3 次。

1.3.2 病毒在4%仿海鹽水中活性的測定

實驗分設(shè)為2 組。22℃組(室溫)和4℃組每組各8 管濃度為4% NaCl 滅菌鹽水做為仿海鹽水,每管0.9 mL。各取100 μL 105.33TCID50/mL 病毒液加至各組鹽水管中,分別在22℃(室溫)和4℃下存放0 h、1 d、2～5 d、7 d 和9 d 收集鹽水和病毒液混合液測定滴度。實驗中除溫度外,環(huán)境濕度和風速基本一致,實驗重復(fù)3 次。

1.3.3 病毒滴度測定

10 倍系列稀釋的病毒液接種于單層VeroE6 細胞中,37℃5% CO2孵育1 h 后,棄掉吸附液,加入200 μL 病毒培養(yǎng)基(DMEM 培養(yǎng)基中加入100 U/mL 青霉素,100 μg/mL 和2%胎牛血清),37℃,5%CO2孵育3 d,觀察細胞CPE,Reed and Muench 方法計算病毒組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)[5]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

病毒滴度在不同組之間存在的差異運用GraphPad Prism 8.0 軟件進行ANOVA 單因素方差分析。P<0.05 時,認為兩者之間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 病毒在三文魚表面活性的測定

將100 μL 106.5TCID50/mL 病毒液放置在三文魚塊表面,分別在22℃(室溫)和4℃條件下放置0 h、1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d,收集三文魚表面病毒液,測定滴度。起始(0 h)收集病毒液,測定滴度為105.0TCID50/mL。三文魚放置在4℃時,在1 d、2 d、3 d 和4 d 均能測得病毒滴度,分別為104.17TCID50/mL、103.57TCID50/mL、103.11TCID50/mL 和 102.44TCID50/mL,病毒活力在1 d 內(nèi)衰減超過50%,5 d 后病毒滴度低于檢測下限;放置在22℃(室溫)時,僅在1 d 測得病毒滴度,為102.67TCID50/mL,病毒活力在1 d 內(nèi)衰減超過50%,2 d 后病毒滴度均低于檢測下限。見圖1、圖2。

2.2 病毒在4%仿海鹽水中活性的測定

圖1 在4℃和22℃條件下,不同時間三文魚表面病毒液滴度Figure 1 Virus titers on salmon surfaces at 4℃and 22℃in different times

圖2 在4℃和22℃條件下,三文魚表面病毒液與初始病毒液滴度比值Figure 2 Present virus titer/initial virus titer on salmon surfaces at 4℃and 22℃in different times

將100 μL 105.33TCID50/mL 病毒液放入4%仿海鹽水中,分別在22℃(室溫)和4℃放置0 h、1 d、2～5 d、7 d 和9 d,收集鹽水病毒混合液,測定病毒滴度。起始(0 h) 收集混合液,測定滴度為104.33TCID50/mL。4℃時,1～5 d 和7 d 均能測得病毒滴度,分別為103.89TCID50/mL、103.44TCID50/mL、103.28TCID50/mL、103TCID50/mL、102.67TCID50/mL 和102.17TCID50/mL,病毒活力在1 d 內(nèi)衰減超過50%,9 d 后病毒滴度低于檢測下限;22℃(室溫)時,僅在1 d、2 d 測得病毒滴度,分別為102.78TCID50/mL 和102.44TCID50/mL,病毒活力在1 d 內(nèi)衰減超過50%,3 d 后病毒滴度均低于檢測下限。見圖3、圖4。

3 討論

圖3 不同溫度條件下,不同時間4% NaCl仿海鹽水中病毒液滴度Figure 3 Virus titers in 4% NaCl imitation seawater at 4℃and 22℃in different times

圖4 不同溫度條件下,4% NaCl 仿海鹽水中病毒液與初始病毒液滴度比值Figure 4 Present virus titer/initial virus titer in 4% NaCl imitation seawater at 4℃and 22℃in different times

SARS-CoV-2 病毒主要通過飛沫傳播和密切接觸傳播[1-3],所以病毒在環(huán)境中的穩(wěn)定性和在物體表面的活性直接影響了病毒傳播的效能。眾所周知,病毒通常在零度下易于長期存活,但在通常4℃或不同室溫條件下活性維持時間不得而知,而這樣的溫度,也是日常生活中三文魚等食材最常處于的溫度,研究調(diào)查病毒在這樣條件下的活力,對海鮮市場的病毒控制具有重要意義。

結(jié)果顯示4℃～22℃條件下,三文魚表面病毒可存活1～4 d,4% NaCl 仿海鹽水中病毒可存活2～7 d,從病毒滴度結(jié)果看出,SARS-CoV-2 在三文魚表面具有一定活性,因此被病毒污染的三文魚在解凍后低溫狀態(tài)具有較長時間活性;病毒在仿海水中也能穩(wěn)定存活,所以伴隨運輸?shù)暮Ｋ缬形廴?也會攜帶病毒,并具一定時間的活性。有研究對三文魚體內(nèi)ACE2 進行分析,其結(jié)構(gòu)異于人ACE2,所以無法與病毒S 蛋白結(jié)合,從而不能感染病毒[6],北京新發(fā)地三文魚案板上檢測到的病毒通過全基因組測序比對,發(fā)現(xiàn)病毒與歐洲流行株相似。所以推測三文魚在進口前就已被環(huán)境或者操作人員污染而粘附病毒。所以對進口食品的病毒檢疫、售賣環(huán)境的消毒和經(jīng)手人員的預(yù)防都應(yīng)該給予重視。

本文通過三文魚魚肉表面病毒活性的檢測獲得的結(jié)果,讓我們初步了解在三文魚表面病毒隨溫度的活性變化,掌握新冠病毒的一些生物特性,對我們進一步了解病毒和制定有效的防控策略提供有力的科學(xué)支撐。