史 洺 邵思邁 余姊陽 原 野 張振強(qiáng) 張紫娟 郝 莉?

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院,鄭州 450046)

線粒體在生物代謝和能量轉(zhuǎn)換中處于核心地位,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)自噬、鈣穩(wěn)態(tài)、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等過程。細(xì)胞內(nèi)線粒體呈動(dòng)態(tài)變化的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),線粒體動(dòng)力學(xué)在多種神經(jīng)退行性疾病進(jìn)程中至關(guān)重要。目前AD 發(fā)生的病理及分子機(jī)制尚不清楚,但迄今為止的研究表明,線粒體在其發(fā)病過程中占重要地位。

1 線粒體動(dòng)力學(xué)及其功能

線粒體是細(xì)胞的“動(dòng)力源”,通過氧化磷酸化產(chǎn)生細(xì)胞代謝所需能量。線粒體在胞質(zhì)中融合、分裂、降解和再生的過程統(tǒng)稱為線粒體動(dòng)力學(xué)。

分裂可以改變細(xì)胞中線粒體的形態(tài),例如神經(jīng)細(xì)胞中分布于胞體和樹突的線粒體較長(zhǎng),在軸突中則較為短小;分裂還可以切除不可修復(fù)的、功能失調(diào)的線粒體碎片,通過線粒體的自噬作用清除;在細(xì)胞凋亡過程中,線粒體分裂還能促進(jìn)局部促凋亡細(xì)胞色素c 釋放到胞質(zhì)[1]。線粒體融合通過線粒體DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的相互補(bǔ)充確保了細(xì)胞器內(nèi)容的均一性,并且可能由此拮抗過量活性氧(ROS)產(chǎn)生導(dǎo)致的線粒體DNA 損傷和功能障礙[2]。線粒體分裂和融合的平衡隨著各種生理信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化而呈周期性改變。

2 線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1

哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),與動(dòng)力有關(guān)的動(dòng)力相關(guān)蛋白1 (dynamin-related protein1,Drp1 或 dynamin-like protein1,DLP1)在線粒體分裂中起關(guān)鍵作用。Drp1屬于發(fā)動(dòng)蛋白超家族,最早被發(fā)現(xiàn)于酵母,稱為發(fā)動(dòng)蛋白1(Dynamin1,DNM1),故又名DNM1L 蛋白。

目前研究認(rèn)為,哺乳動(dòng)物細(xì)胞中線粒體分裂和融合幾乎都只發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸區(qū)[3]。線粒體分裂可分為三步:1)Drp1 蛋白從胞漿至線粒體外膜聚合;2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌動(dòng)蛋白共同驅(qū)動(dòng)Drp1 蛋白收縮;3)Drp1 蛋白進(jìn)一步收縮導(dǎo)致線粒體分裂。

線粒體分裂存在潛在復(fù)雜且嚴(yán)格的調(diào)節(jié)機(jī)制。Drp1 及其多種受體促進(jìn)線粒體分裂,首先在預(yù)先標(biāo)記的分裂位點(diǎn)周圍自組裝成螺旋狀聚合物,繼而寡聚化從而收縮ER 與線粒體接觸部位的膜,并產(chǎn)生切斷細(xì)胞器所需的收縮力[4]。但是,Drp1 如何通過受體被募集到線粒體表面的分子機(jī)制尚不清楚,最新研究發(fā)現(xiàn),在線粒體與ER 接觸部位募集含有反式高爾基網(wǎng)絡(luò)的磷脂酰肌醇4-磷酸鹽的囊泡可能會(huì)觸發(fā)導(dǎo)致線粒體分裂的最終事件[5]。

2.1 Drp1 結(jié)構(gòu)

完整的Drp1 分子結(jié)構(gòu)主要包含以下結(jié)構(gòu)域:N端的GTP 酶結(jié)構(gòu)域、中間的螺旋形結(jié)構(gòu)域、C 端的GTP 酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(GED)以及B-Insert 區(qū),功能區(qū)還包括三個(gè)束效應(yīng)元件(BSE)與GTPase 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行通信等。Drp1 本質(zhì)上是一類GTP 水解酶,通過N端的GTP 酶結(jié)構(gòu)域水解GTP 為線粒體提供分裂所需能量,而GED 和InsertB 區(qū)可以通過分子間的相互作用或化學(xué)修飾的方式影響Drp1 的活性從而影響其功能[6]。

通過對(duì)秀麗隱桿線蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的動(dòng)力蛋白同源物的分析已鑒定出Drp1,并表明Drp1是進(jìn)化上高度保守的分裂因子[7],使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫對(duì)不同進(jìn)化程度物種的基因比對(duì)分析同樣如此[8]。人類Drp1 突變引起相關(guān)疾病,例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不全和神經(jīng)退行性疾病,但突變體的所有位置在與膜分裂和細(xì)胞器分裂相關(guān)的發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白家族的所有成員中是完全保守的[9]。因此,盡管Drp1 具有多種突變體,但所有的變異體都具有這些結(jié)構(gòu)域,說明這是其發(fā)揮功能所必需的。

2.2 Drp1 的活性調(diào)控

不同生物功能的細(xì)胞有多種翻譯后水平機(jī)制調(diào)控Drp1 活性,如磷酸化、泛素化、SUMO 化、亞硝基化等。增加Drp1 GTP 水解活性會(huì)使構(gòu)象變化,從而增加線粒體收縮和線粒體小管的斷裂緊密度。

2.2.1 Drp1 與磷酸化

Drp1 磷酸化與去磷酸化是激活和失活的過程。Drp1 的磷酸化可發(fā)生在不同的位點(diǎn),包括Ser600 位點(diǎn)、Ser616 位點(diǎn)、Ser637 位點(diǎn)、Ser585 位點(diǎn)以及Ser693 位點(diǎn)等。

Ser600 包含在C 末端GTPase 效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域的一致性CaMKI 磷酸化位點(diǎn)內(nèi)。在神經(jīng)元和HeLa 細(xì)胞中,在Ser600 處Drp1 的磷酸化與Drp1 向線粒體的易位增加有關(guān),而在體外,Drp1 的磷酸化導(dǎo)致其對(duì)Fis1 的結(jié)合增加[7]。當(dāng)Drp1 被Ser616 磷酸化的激酶激活時(shí),會(huì)引起線粒體分裂[10-11],并參與線粒體鈣單向介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的極化和趨化作用[12]。例如,電離輻射可刺激Drp1 激活,引發(fā)線粒體分裂,但其觸發(fā)的是Ser616 處磷酸化,在Ser637 處未觸發(fā)[13]。Drp1 在Ser637 的GED 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的磷酸化可以抑制GTP 酶的活性和線粒體的分裂[14-15]。從機(jī)制上講,GTPase 活性的這種變化可能是由于GTP結(jié)合或中間結(jié)構(gòu)域與GED 結(jié)構(gòu)域的相互作用減少所致。因此,Ser637 處的磷酸化導(dǎo)致Drp1 功能和線粒體形態(tài)明顯改變,可能參與細(xì)胞線粒體分裂的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié),但最近研究發(fā)現(xiàn)Drp1 中的Ser637 磷酸化狀態(tài)不是控制Drp1 募集到線粒體的決定因素[16]。此外,Drp1 在Ser585 位點(diǎn)的磷酸化促進(jìn)有絲分裂細(xì)胞的線粒體分裂,外源表達(dá)未磷酸化突變體Drp1Ser585 有助于減少線粒體有絲分裂[17]。GSK3beta 通過634-690 殘基與Drp1 結(jié)合,并在GED 結(jié)構(gòu)域中磷酸化Ser693,導(dǎo)致體外GTPase 活性降低,線粒體分裂減少,線粒體形態(tài)延長(zhǎng)[18]。

Drp1 的單個(gè)磷酸化位點(diǎn)可以在體內(nèi)調(diào)節(jié)線粒體的分裂和融合的進(jìn)程,促進(jìn)或抑制線粒體分裂,這些位點(diǎn)磷酸化的平衡調(diào)控著Drp1 的活性。盡管如此,Drp1 仍是目前研究公認(rèn)的介導(dǎo)線粒體分裂的最關(guān)鍵蛋白。

2.2.2 Drp1 與泛素化

泛素化即通過泛素-蛋白酶體途徑降解底物,是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控的一個(gè)重要方式,在蛋白質(zhì)定位、代謝、功能和降解方面起重要作用。

線粒體外膜存在E3 泛素化連接酶MARCH5(membrane-associated,RING-CH5),它可泛素化Drp1 并調(diào)節(jié)線粒體分裂。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)了有爭(zhēng)議的結(jié)果。首先,MARCH5 與Drp1 相互作用并導(dǎo)致其泛素化和蛋白酶體依賴性降解,從而抑制線粒體過度分裂[19-20]。Karbowski 的小組發(fā)現(xiàn)MARCH5 敲除選擇性地抑制Drp1 的線粒體受體MiD49 的泛素化和蛋白酶體降解,從而導(dǎo)致線粒體斷裂,支持MARCH5 是線粒體分裂的負(fù)調(diào)節(jié)因子的可能性[21]。但在其它研究中觀察到了MARCH5 在線粒體分裂中的相反作用,即其對(duì)Drp1 呈正向調(diào)節(jié)作用。研究人員發(fā)現(xiàn)MARCH5 突變和MARCH5 RNA 干擾可導(dǎo)致Drp1 在細(xì)胞內(nèi)的分布和線粒體結(jié)合的異常,Drp1的異位表達(dá)反過來逆轉(zhuǎn)了MARCH5 Ring 突變體誘導(dǎo)的線粒體異常,提示MARCH5 與Drp1 具有很強(qiáng)的功能依賴性[22]。另一項(xiàng)研究中,PARK 等人發(fā)現(xiàn)MARCH5 蛋白低表達(dá)的細(xì)胞中,線粒體高度互連且拉長(zhǎng)。由此,缺乏MARCH5 導(dǎo)致線粒體延伸,其通過阻斷Drp1 活性、促進(jìn)線粒體中融合相關(guān)蛋白Mfn1 的積累來促進(jìn)細(xì)胞衰老[23]。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體分裂需要MARCH5,它是OMM 上的E3 泛素連接酶,其C-末端結(jié)構(gòu)域在MARCH5 底物的降解中起關(guān)鍵作用,可能是通過促進(jìn)OMM 中泛素化蛋白的釋放[24]。MARCH5 對(duì)其底物尤其是Drp1 的調(diào)控可能存在一些特異性,與修飾位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)變化以及是否與Drp1 受體相互作用等有關(guān),并且需要綜合考慮多種信號(hào)平臺(tái)的參與,包括細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白表達(dá)的變化以及與分裂相關(guān)分子活性的調(diào)節(jié)。

此外,Drp1 被APC/CCdh1(促進(jìn)相位的復(fù)合物/環(huán)體及其輔激活物Cdh1)E3 泛素連接酶復(fù)合物泛素化時(shí),這種在分裂周期由M 到G1 期轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)因子,可調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂時(shí)G1/S 期線粒體形態(tài)[25]。另一種E3 連接酶Parkin,在穩(wěn)定狀態(tài)下主要定位于胞漿中,也誘導(dǎo)Drp1 的蛋白酶體降解[26],提示Parkin 以Drp1 為底物,在線粒體分裂中起抑制作用。

這些研究表明Drp1 泛素化修飾在線粒體分裂過程中有重要作用,但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

2.2.3 Drp1 與SUMO 化

小泛素相關(guān)修飾物(smallubiquitinrelatedmodifier,SUMO)是一種類泛素分子,主要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的相互作用、細(xì)胞內(nèi)定位和活性等。SUMO 和泛素修飾同一底物時(shí),SUMO 化通常阻止底物被UPS 降解,有時(shí)兩種修飾方式也協(xié)同調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能,即二者既有拮抗作用,也有協(xié)同作用。

研究發(fā)現(xiàn),DRP1 是MAPL(線粒體錨定蛋白連接酶)的底物,MAPL 同時(shí)具有泛素連接酶和SUMO連接酶活性,可以通過促進(jìn)的Drp1SUMO 化顯著提高被募集到線粒體分裂位點(diǎn)上形成的復(fù)合體的穩(wěn)定性,從而增強(qiáng)線粒體分裂[27-28]。SUMO 化的Drp1在功能上穩(wěn)定了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的接觸位點(diǎn),這些位點(diǎn)與線粒體收縮,鈣離子通道,線粒體嵴重建和細(xì)胞色素c 釋放有關(guān)[29]。

2.2.4 Drp1 與亞硝基化

蛋白質(zhì)巰基亞硝基化是指一氧化氮及其衍生物修飾蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基-SH 生成-SNO,這是一氧化氮發(fā)揮其廣泛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的重要途徑。

S-亞硝基谷胱甘肽還原酶(GSNOR)是一種重要的脫氨酰化酶,研究表明GSNOR 缺乏會(huì)促進(jìn)線粒體亞硝基化應(yīng)激,包括Drp1 和Parkin 的過度S-亞硝基化,從而損害線粒體動(dòng)力學(xué)和線粒體[30]。在分子水平上,也有報(bào)道稱Drp1 在受到NO 的S-亞硝基化作用時(shí)可以呈活性形式,從而導(dǎo)致線粒體過度分裂并引起神經(jīng)毒性[31]。MAP1B-LC1(亞硝化微管相關(guān)蛋白1B-輕鏈1)被鑒定為MARCH5 的結(jié)合蛋白,研究發(fā)現(xiàn)MARCH5 特異性識(shí)別并誘導(dǎo)S-亞硝基化修飾的MAP1B-LC1 的降解[32],這表明MARCH5 具有選擇性識(shí)別其底物并部分地通過降解活性Drp1 和MAP1B-LC1 來防止線粒體動(dòng)力學(xué)失衡的作用。

蛋白質(zhì)巰基亞硝基化對(duì)細(xì)胞生存的作用需要結(jié)合其在組織中的位置結(jié)構(gòu)、功能水平和生理階段等綜合效應(yīng),但目前研究表明Drp1 亞硝基化對(duì)細(xì)胞的損害與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。

3 Drp1 與AD

蛋白組學(xué)分析證明了退行性疾病與全身變化有關(guān),其中包括線粒體功能障礙,能量減少和氧化應(yīng)激等[5]。Drp1 廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),進(jìn)一步的觀察表明,Drp1 在抑制性神經(jīng)元中高度異質(zhì)表達(dá)。在透射電鏡下,Drp1 在樹突中的分布高于神經(jīng)元中的其他區(qū)域,并且只有少量的Drp1 位于線粒體中[33]。在應(yīng)激狀態(tài)下,胞漿內(nèi)的Drp1 以多種形式修飾后,活性發(fā)生改變,導(dǎo)致其聚集在線粒體外膜,進(jìn)一步引起線粒體分裂。

3.1 Drp1 介導(dǎo)的線粒體分裂與AD

研究認(rèn)為,Drp1 高表達(dá)引起的線粒體分裂增多及碎片化與AD 病理高度相關(guān)。研究人員從患有早老素1(PS1)突變患者的外周血中分離出單核細(xì)胞,其衍生的神經(jīng)元中,融合相關(guān)蛋白Mfn1 顯著減少,而DRP1 增加[34]。AD 小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,認(rèn)知功能下降與Drp1 的過度活化相關(guān)[35]。

由于線粒體過度分裂與AD 等神經(jīng)退行性疾病相關(guān),因此調(diào)控線粒體分裂有望成為一種新的治療策略。但與期望結(jié)果不同,Drp1 敲低雖然減少了線粒體碎片化,但不能提高細(xì)胞生存能力或線粒體功能。因此,糾正線粒體形態(tài)或分布無法恢復(fù)其生物能效率,神經(jīng)元仍無法恢復(fù)健康狀態(tài)[36]。

化合物Mdivi-1 是目前公認(rèn)的Drp1 抑制劑,可直接減少線粒體片段化[37]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,Mdivi-1 預(yù)處理可防止Drp1 依賴性的過度線粒體分裂,減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡和突觸損傷,并改善長(zhǎng)期認(rèn)知功能[38]。而對(duì)Mdivi-1 作用機(jī)制的研究表明,慢病毒低表達(dá)Drp1 不能降低NMDA 誘導(dǎo)的線粒體分裂和毒性。因此Mdivi-1 對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用可能不依賴于Drp1,而主要通過調(diào)節(jié)線粒體功能和細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)來防止NMDA 受體介導(dǎo)的興奮性毒性[39]。

雖然如此,但值得思考的是,抑制Drp1 的表達(dá)是否對(duì)挽救AD 病程起至關(guān)重要的作用。最近的研究表明,細(xì)胞損傷時(shí),鈣離子流入和Drp1 介導(dǎo)的損傷部位線粒體快速分裂有助于極化修復(fù)反應(yīng)。顯然,線粒體分裂會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞存活所需的局部信號(hào)[40]。功能紊亂的線粒體積累與衰老有關(guān),但線粒體分裂對(duì)衰老過程的影響需要更深入的研究。于果蠅體內(nèi)的研究顯示上調(diào)Drp1 可促進(jìn)線粒體分裂,延長(zhǎng)果蠅壽命和健康期[41]。Drp1 通過mRNA 剪接可產(chǎn)生多種亞型,其中Drp1ABCD 亞型富含樹突棘,并且其作用獨(dú)立于線粒體分裂,調(diào)節(jié)突觸后網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、神經(jīng)元形態(tài)和功能[42]。Drp1的外源表達(dá)降低了Aβ 轉(zhuǎn)基因果蠅大腦中的ATP 水平,并抑制了神經(jīng)元變性,這是通過保護(hù)線粒體功能實(shí)現(xiàn)的,提示Drp1 可能是AD 的潛在治療策略[43]。

3.2 Drp1 與AD 病理產(chǎn)物

AD 的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確,目前有許多假說,包括線粒體功能障礙、β 淀粉樣斑塊沉積、tau蛋白學(xué)說、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、自噬等,其中線粒體動(dòng)力學(xué)改變尤其是Drp1 的表達(dá)與AD 病理產(chǎn)物相互影響逐漸備受關(guān)注。

AD 病理產(chǎn)物主要包括Aβ 沉積和異常磷酸化的tau 蛋白。Aβ-42通過靶向線粒體誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,包括促進(jìn)線粒體分裂,破壞線粒體膜電位,增加細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和激活線粒體自噬過程等[44]。Drp1 是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdk5)的直接靶標(biāo),并且Cdk5 介導(dǎo)的Drp1 在Ser579 的磷酸化,調(diào)節(jié)Aβ1-42誘導(dǎo)的線粒體分裂和神經(jīng)元毒性[45]。Aβ 通過Akt 的持續(xù)磷酸化直接激活Drp1 并通過mTOR 途徑抑制自噬。這些變化共同引起大量線粒體斷裂,導(dǎo)致ROS 介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[46]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明,反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞中線粒體分裂和融合的多態(tài)性調(diào)節(jié)是由炎癥條件下的獨(dú)特信號(hào)介導(dǎo)的,并通過產(chǎn)生ROS 來調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型[47]。

tau 對(duì)肌動(dòng)蛋白的穩(wěn)定作用對(duì)于蛋白質(zhì)的神經(jīng)毒性至關(guān)重要,研究表明肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的線粒體動(dòng)力學(xué)破壞是體內(nèi)神經(jīng)元tau 毒性的直接機(jī)制[48]。而對(duì)AD 患者以及AD 轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中的GTPase 活性檢測(cè)表明,線粒體分裂相關(guān)的GTP 酶活性顯著升高,其對(duì)于線粒體片段化至關(guān)重要。Drp1、Aβ 與異常磷酸化tau 相互作用可能加劇線粒體過度斷裂,線粒體功能異常和突觸缺乏,最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和認(rèn)知能力下降[49]。

這種Drp1 參與的線粒體動(dòng)力學(xué)改變和非局限于線粒體的病理改變,在AD 病程中起重要作用。因此針對(duì)抑制Drp1,Aβ 和tau 表達(dá)的治療可能會(huì)降低其相互作用,從而保護(hù)神經(jīng)元免受過量Drp1,Aβ和異常磷酸化tau 的毒性傷害。

4 結(jié)語

Drp1 的表達(dá)與調(diào)控影響線粒體動(dòng)力學(xué)平衡,異常的線粒體分裂導(dǎo)致線粒體從管狀形態(tài)碎片化,相反,線粒體的過度分裂導(dǎo)致相鄰線粒體融合。Drp1通過介導(dǎo)哺乳動(dòng)物的線粒體分裂過程影響細(xì)胞存活和凋亡,其功能可能在很大程度上超出線粒體分裂。

因此,筆者認(rèn)為Drp1 的表達(dá)與功能需結(jié)合環(huán)境因素、生物體的生理病理狀態(tài)、多種胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及作用途徑綜合研究。目前研究對(duì)Drp1 對(duì)線粒體分裂的作用尚不完全明確,不能單面評(píng)估其對(duì)細(xì)胞、疾病乃至整個(gè)生命體的作用。我們希望Drp1 與線粒體之間的關(guān)系可能對(duì)AD 的研究和臨床治療具有指導(dǎo)意義,但是在體內(nèi)和體外闡明這種關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制后,它才能為治療線粒體分裂相關(guān)疾病樹立一個(gè)里程碑。