王 崢苗晉鑫

(河南中醫(yī)藥大學,中醫(yī)藥科學院,鄭州 450000)

黑色素瘤是皮膚中產(chǎn)生色素的黑素細胞的惡性腫瘤,其特征是高度侵襲和遠端器官轉(zhuǎn)移[1]。黑色素瘤的發(fā)病率逐年上升,遠超其他癌癥[2]。盡管黑色素瘤治療方法取得了進展,但預后仍然很差,轉(zhuǎn)移的患者生存期僅6～9 個月,5 年的生存期不及5%[3]。研究腫瘤發(fā)病機制、浸潤轉(zhuǎn)移及藥物的治療反應對改善腫瘤患者預后至關重要[4]。小鼠模型是臨床前應用最廣泛的動物模型,其為研究黑色素瘤的發(fā)病機制、轉(zhuǎn)移及藥物評價的重要工具。黑色素瘤小鼠模型可分為誘發(fā)性模型、移植性模型、轉(zhuǎn)基因模型[5-7]。通過紫外線或致癌物誘發(fā)小鼠模型,確定黑色素瘤發(fā)生的易感性和風險因素。同種移植模型將黑素瘤細胞移植到相同的物種和遺傳背景中,由于動物在這種模型中具有功能性免疫系統(tǒng),用于評估癌癥與免疫細胞之間免疫療法以及相互作用。異種移植模型將人黑素瘤細胞植入免疫缺陷小鼠中,以快速識別造成惡性腫瘤的關鍵途徑。基因表達經(jīng)過修飾的轉(zhuǎn)基因小鼠來確定黑色素瘤的發(fā)生機制,用于闡明基因功能并確定治療的關鍵靶點。每種模型都揭示了黑色素瘤的獨特見解,本文總結(jié)近20 年黑色素瘤小鼠模型研究,總結(jié)和比較分析黑色素瘤小鼠模型的制備、表型、優(yōu)缺點及適用范圍,為優(yōu)化黑色素瘤小鼠模型及增進我們對疾病的了解并推動治療的發(fā)展提供科學依據(jù)。此外,小鼠黑色素瘤模型仍需要更廣更深的拓展,對已報道的模型結(jié)合其本身特點及多學科知識的疊加運用,建立更加符合人類臨床的動物模型并獲取更準確的研究結(jié)果。

1 誘導性模型

1.1 紫外線誘導的小鼠模型

通過紫外線照射獲得的黑色素瘤模型被認為是臨床上可靠的模型[8]。UV 在黑色素瘤小鼠中為強誘導劑,在黑色素存在的情況下,可導致更早和更多的腫瘤形成。除直接誘變作用外,UV 可誘導角質(zhì)細胞損傷導致暴露于UV 小鼠的Myd88 TLR4+中性粒細胞增加。Myd88/TLR4 中性粒細胞可在體內(nèi)和體外增強小鼠或人黑色素瘤細胞的血管養(yǎng)分,通過影響微環(huán)境來增強黑色素瘤的產(chǎn)生[9]。但暴露于紫外線(短期或較低劑量)的成年小鼠表皮是很難形成黑色素細胞特征[10]。最近的研究表明DNA 損傷需要存在其他失調(diào)的基因(通過表觀遺傳事件)來啟動紫外線誘導的黑色素生成[11]。Noonan等[12]將HGF/SF cDNA 表達的小鼠置于日光燈下用不同劑量(6.24 kJ/m2UVB、3.31 kJ/m2UVA、0.03 kJ/m2UVC)進行紫外誘導15 min。誘導后的小鼠出現(xiàn)皮膚發(fā)紅,偶有淺表皮脫屑,在組織病理學中觀察到小鼠產(chǎn)生的大多數(shù)皮膚黑色素瘤中具有真皮成分,病變顯示具有垂直生長期或浸潤性惡性黑色素瘤以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,這些病變與人類患者黑色素瘤頁面狀擴散的表皮內(nèi)病變特征相似[13]。這種實驗性小鼠模型中黑素細胞瘤病因、組織病理學和分子排列等方面類似于人黑色素瘤。單獨和協(xié)同作用的遺傳和環(huán)境等危險因素的評估提供了研究平臺,有望利用這種模型有效促進防曬策略和黑色素瘤治療[14]。但野生型或正常型小鼠一般不易發(fā)生UV 誘導的黑色素瘤,因此UV 誘導的黑色素瘤小鼠模型往往需要聯(lián)合免疫缺陷小鼠,其操作技術較難、成本較高。

1.2 化學誘導

化學致癌物誘導黑色素瘤小鼠模型大多采用DMBA 和TBA 誘導。DMBA 是一種免疫抑制多環(huán)芳烴,其致癌機理是其活性代謝物被CYP450 代謝成致癌物1,2-環(huán)氧化物-3,4-二醇DMBA,進而損傷DNA[15]。TPA 是通過激活蛋白激酶C 充當腫瘤啟動子,進而使一些生長因子受體磷酸化[16]。Elmets 等[17]用100 μL 的0.1%、0.5%、1%的DMBA的丙酮溶液涂抹于6 周齡雌性C3H/Hen 小鼠已剃毛的背部皮膚。在DMBA 涂抹一周后,每周兩次將TPA(40 nmol)施用到相同部位。幾周后,小鼠背部皮膚上出現(xiàn)色素沉著斑點。組織學研究表明,小鼠真皮組織中色素細胞積累,某些色素細胞表現(xiàn)出嵌套的形態(tài)學模式。此類模型可用于研究陽光對黑素細胞痔轉(zhuǎn)化為侵襲性的黑色素瘤的過程中起的作用。由于小鼠模型的免疫系統(tǒng)功能全面,因此也可以用于研究免疫治療策略。但是,化學誘導黑色素瘤小鼠模型缺乏與人類疾病的臨床相關性。

2 移植性模型

移植模型是目前應用最多的腫瘤模型,即用腫瘤組織或細胞(動物或人)移植到動物體內(nèi)所形成的腫瘤動物模型[18]。我們根據(jù)移植物來源,即同種移植模型和異種移植模型進行總結(jié)分析(表1)。

2.1 同種移植模型

同種移植模型是將小鼠黑素瘤細胞接種到具有相同遺傳背景的小鼠中獲得小鼠黑素瘤模型[19]。此模型包括ICR 小鼠的Harding-Passey 黑色素瘤模型、DBA 小鼠的S91 黑色素瘤模型、C57BL/6 小鼠的B16 黑色素瘤模型,其中C57BL/6 小鼠的B16 黑色素瘤是最常用模型[20]。同種移植模型具有免疫能力,可通過黑色素細胞與免疫細胞之間固有的相互作用來研究黑色素瘤與微環(huán)境的關系。然而,該移植模型的原發(fā)腫瘤出現(xiàn)與轉(zhuǎn)移發(fā)生之間時間間隔短,不利于藥物藥效研究;且腫瘤細胞為鼠源,與人類腫瘤有一定的差異[21]。

表1 黑色素瘤小鼠動物模型比較Table 1 Comparison of mouse animal models of melanoma

2.1.1 同種移植皮下模型

將C57BL/6J 小鼠皮下移植5×105的B16-OVA黑色素瘤細胞,成功建立黑色素瘤皮下移植瘤模型,用于評價VSV-GP-GFP 的治療效果[22]。姚香利等[23]分別采用從小鼠中提取原代腫瘤細胞及體外培養(yǎng)的B16 細胞植入C7BL/6 小鼠體內(nèi),接種后小鼠均出現(xiàn)了精神萎靡、食物攝入量減少、毛發(fā)粗糙等特征。該研究表明,原代細胞接種的小鼠黑色素實體瘤生長速度較快,成瘤率較高,可用于體內(nèi)篩選和評價特定化合物抗腫瘤活性。Soica 等[24]對8周大的C57BL/6J 雌性小鼠皮下接種B164A5 細胞,并給予GCDG 復合物治療。研究發(fā)現(xiàn),治療組在腫瘤體積和重量方面明顯降低。組織病理觀察發(fā)現(xiàn),未治療組腫瘤病變較重,具有高度增殖性。B164A5細胞系是可導致色素沉著過度的彩色鼠黑色素瘤細胞類型之一,可引起小鼠模型產(chǎn)生紅斑。因此,此模型也可用于研究皮膚血紅蛋白水平與腫瘤發(fā)展的相互關系。

2.1.2 同種移植轉(zhuǎn)移模型

孟星君等[25]比較了尾靜脈注射、腹腔注射和皮下注射等不同方式給C57BL/6 小鼠接種B16 F10細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有尾靜脈注射方法接種腫瘤的小鼠出現(xiàn)了肺部轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。Gheorgheosu 等[26]向C57BL/6 小鼠腹膜內(nèi)接種B16 黑色素瘤細胞,接種后小鼠的皮膚、肺、肝和脾等不同器官出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。皮膚病理學顯示腫瘤由圓形和橢圓形的腫瘤細胞組成。肺部血管出現(xiàn)大量腫瘤增殖并伴隨支氣管炎癥,肝出現(xiàn)了中度瘀滯和點狀腫瘤。因此不同接種部位通常會改變腫瘤的生長特性[27]。此小鼠模型與人類黑色素瘤臨床轉(zhuǎn)移十分相似,操作簡單,重現(xiàn)性好,可用于評估藥物抗黑色素瘤轉(zhuǎn)移作用。但與人類黑色素瘤相比,小鼠細胞系的黏附蛋白和生長因子有較大不同,因此無法完全代表人類疾病[21]。

2.2 異種移植模型

異種移植模型是將人類的腫瘤細胞或組織移植入免疫缺陷型實驗動物體內(nèi)[28]。此模型一般采用免疫缺陷型小鼠,例如無胸腺裸鼠、CB17-SCID 小鼠、NOD/SCID 小鼠、NSG 小鼠。一般來說,免疫缺陷程度越高,成瘤性越好。癌癥的相關研究中,人源細胞系異種移植(cell-line-derived xenograft,CDX)模型和患者腫瘤組織異種移植(patienT--derived xenograft,PDX)模型已得到廣泛應用[29-30]。異種移植模型的建立依賴于受體動物免疫功能的缺失。異種移植的優(yōu)勢在于腫瘤與皮膚轉(zhuǎn)移發(fā)展時間較長,允許人類黑素瘤細胞與鼠基質(zhì)、淋巴管相互作用,便于評估腫瘤的生長行為及抗癌藥的體內(nèi)反應。但是,這類模型有一些限制,因為小鼠免疫功能低下,不能用于檢查免疫療法的功效[31]。

2.2.1 CDX 模型

將5×106的人A375 黑色素瘤細胞皮下注射NOD/SCID 小鼠腹側(cè)的雙側(cè),成功構(gòu)建黑色素瘤CDX 模型,用于評價VSV-GP-GFP 的治療效果[32]。Liang 等[33]向無胸腺裸雌鼠皮下接種人A375 黑色素瘤細胞,并給予伊曲康唑口服溶液治療。研究發(fā)現(xiàn),伊曲康唑可以抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤擴散。Gowda 等[34]將1ⅹ106的UACC 903 細胞或1205 Lu細胞皮下注射4～6 周齡雌性Athymic-Foxn1nu 裸鼠,并給予 CelePluM-777 治療。研究發(fā)現(xiàn),CelePluM-777 可通過COX-2 和STAT3 協(xié)同抑制異種移植的黑色素瘤腫瘤生長并對其它細胞無毒性。Hubmann 等[35]采用具有BRAF V600E突變和CDKN2A外顯子2 缺失的黑色素瘤細胞系518A2,皮下接種雌性無胸腺裸鼠,建立異種黑色素瘤小鼠模型并給予膠質(zhì)毒素治療。小鼠治療后發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯減小并發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)毒素治療惡性腫瘤與NOTCH2 相關。

2.2.2 PDX 模型

Hoffman 等[36]將75 歲女性患者胸壁中BRAFV600E突變片段的黑色素瘤組織移植到裸鼠的胸壁以模仿從患者身上切除的部位。此模型是通過將人類腫瘤組織異種移植到免疫功能低下的小鼠體內(nèi)而開發(fā)的,以解決各種惡性腫瘤的病因和藥物研究。模型由于可以維持腫瘤異質(zhì)性、基因維持,整體通路活性和突變狀態(tài)的能力及較長模型壽命,因此可以發(fā)展為大型臨床試驗樣研究來研究新藥和抗癌療法[37]。Yan 等[38]將93 個新鮮的患者腫瘤組織切成2×2×2 mm3碎片的大小,皮下接種6 周大的NOD/SCID 雌性小鼠,建立PDX 模型。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型成功植入率為26.9%,保留了病人的腫瘤組織學和遺傳學特征,可模擬潰瘍狀態(tài)對人類黑色素瘤預后的影響。通過優(yōu)化方法,PDX 模型可以保留突變特征并保留其親代腫瘤對應物的組織學特征,應將這些模型視為其他臨床前模型的補充并用于開發(fā)個性化靶向療法。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤樣品的來源和原發(fā)腫瘤的臨床分期是成功建立PDX 模型的兩個重要因素。然而,此模型移植后的潛伏期長,連續(xù)傳代后鼠基質(zhì)被人類基質(zhì)替代,移植率可變,免疫系統(tǒng)受損,有移植物抗宿主病的可能性以及某些免疫細胞功能的缺乏[39]。

3 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

人類黑素瘤中已發(fā)現(xiàn)許多遺傳和表觀遺傳異常[40-41]。致癌基因或抑癌基因的突變導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。小鼠基因編輯技術較成熟,容易獲得基因工程小鼠?？梢酝ㄟ^異位表達癌基因,引入特定的致癌突變或滅活腫瘤抑制基因來對小鼠進行轉(zhuǎn)基因黑色素瘤模型的構(gòu)建。轉(zhuǎn)基因小鼠對黑色素瘤發(fā)生的分子途徑的理解有重要意義[42]。此外,轉(zhuǎn)基因小鼠是可靠且可重現(xiàn)的模型,用來評估受損基因?qū)谏亓錾飳W的影響。此類模型較多,本文主要探討以下幾種常用模型,并對其病理特征、穩(wěn)定性及造模時應注意的問題進行總結(jié)(表2)。

表2 黑色素瘤小鼠模型病理表現(xiàn)、模型穩(wěn)定性及注意事項總結(jié)Table 2 Summary of pathological manifestations,model stability and precautions of melanoma mouse models

3.1 Lum-/-基因敲除小鼠

Lumican 是一種富含亮氨酸的小蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan,SLRP),為膠原原纖維形成的關鍵調(diào)節(jié)劑。黑色素瘤中Lumican 表達降低與浸潤相關[43]。Chakravarti 等[44]利用BamHI 建立的克隆衍生物導入胚胎干細胞,建立Lum-/-轉(zhuǎn)基因小鼠。此小鼠模型證明Lumican 是黑色素瘤腫瘤生長的內(nèi)源性抑制劑,可促進黑色素瘤細胞粘附,同時抑制其遷移能力[45]。該模型可提供與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關機制及可見性腫瘤病變的進展,以及確定負責的黑色素瘤進展的基因。

3.2 Tyr:: N-RasQ61 K轉(zhuǎn)基因小鼠

Ackerman 等[46]使用突變的人N-RasQ61K和SV40 剪接以及聚腺苷酸化序列生成Tyr::NRasQ61K構(gòu)建體,并注射到卵母細胞中,建立Tyr::N-RasQ61K轉(zhuǎn)基因小鼠。研究發(fā)現(xiàn),小鼠具有表皮增生,過度角化和黑色素沉積等特征并伴隨有肺、肝及淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移。當Tyr::N-RasQ61K轉(zhuǎn)基因小鼠進入到Ink4a/ Arf-null背景時,能明顯促進黑色素瘤的發(fā)生。這是由于INK4a/ARF 基因功能失活是人類黑色素瘤的最常見因素之一,其編碼產(chǎn)物為P16INK4a 和 P19ARF[47-48]。但只有當缺乏P16INK4a 和保留P19ARF 的小鼠才顯示出致癌物對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的易感性[49-50]。轉(zhuǎn)基因小鼠中的黑素細胞中H-ras 基因突變,可促進黑素細胞的增生、皮膚色素沉著。在Tyr::N-RasQ61K轉(zhuǎn)基因小鼠中抑制INK4a/ARF 活性可促使結(jié)節(jié)性黑色素瘤的產(chǎn)生[51]。

3.3 BrafV600E轉(zhuǎn)基因小鼠模型

Dhomen 等[52]使用LoxP-stop-LoxP(LSL)/Cre重組酶技術從內(nèi)源性Braf基因中誘導BrafV600E表達,建立BrafV600E轉(zhuǎn)基因黑色素瘤小鼠模型。BrafV600E表達可誘導小鼠形成由色素上皮樣或樹突狀黑素細胞組成的痣,其中大約有70%的BrafV600E小鼠會發(fā)展成黑色素瘤。此模型可模擬人類黑色素瘤的組織和分子特征。附加基因改變可使BrafV600E小鼠發(fā)展為黑色素瘤,沉默PTEN基因可使黑色素瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。Dankort 等[53]建立BrafV600E與PTEN沉默協(xié)同誘導的黑色素瘤小鼠模型,小鼠出現(xiàn)局灶型轉(zhuǎn)移黑色素瘤,真皮中的黑色素瘤有浸潤到皮下組織的跡象,并且所有小鼠的黑色素瘤都已擴散到淋巴結(jié)中。此模型可用于研究關鍵基因的信號轉(zhuǎn)導,并評估靶向相關途徑的藥物影響,有助于開發(fā)治療黑色素瘤的靶向藥物。

4 討論

黑色素瘤的發(fā)病率逐年上升,其發(fā)病機制復雜,并且發(fā)現(xiàn)時多已轉(zhuǎn)移,尚無有效的治療手段。黑色素瘤小鼠模型在研究黑色素瘤發(fā)生發(fā)展機制和治療藥物研究中起著關鍵作用[54]。目前已有三種不同的黑色素瘤小鼠模型,但由于實驗動物與人類基因組、基因調(diào)控、細胞類型、器官結(jié)構(gòu)與組成等方面是有一定差別,這些模型預測藥物治療臨床療效的能力有限。因此,要根據(jù)各種動物模型的特點、適用范圍及研究目的來考量,以選擇和建立理想的動物模型[55]。誘導的小鼠模型模擬人類受外界因素影響獲得的黑色素瘤,常用于研究預防黑色素瘤形成。移植接種的黑色素瘤小鼠模型概括了黑色素瘤原位發(fā)展、轉(zhuǎn)移的一些特點,多用于抗腫瘤和轉(zhuǎn)移藥物評估?；蚬こ绦∈竽Ｐ涂捎糜谘芯刻囟ɑ蚪M改變在黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展的重要性及藥物的靶向治療。根據(jù)實驗目的并結(jié)合模型優(yōu)缺點選擇合適小鼠模型。通過深入研究和技術完善建立良好的黑色素瘤小鼠模型,以便對黑色素瘤發(fā)病機制和相關治療藥物的研究。此外,在構(gòu)建黑色素瘤小鼠模型研究中小鼠和人之間的差異性也應當考慮,例如小鼠的免疫系統(tǒng)及代謝等方面與人類有一定的差距,提示我們可以進一步研究人源化小鼠模型用于黑色素瘤模型的構(gòu)建?？傊?繼續(xù)探究合適黑色素瘤小鼠模型,人們將逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)展機制、與宿主之間的關系、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程,進而找到有效的治療方法。