黃河清，白燕

哮喘是一種常見(jiàn)疾病，可嚴(yán)重降低人們的生活質(zhì)量并影響人類(lèi)健康［1］，其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制目前尚未完全闡明。研究表明，除炎癥和氣道高反應(yīng)外，哮喘患者支氣管氣道結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生改變，即氣道重塑［2］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）作為調(diào)節(jié)氣道重塑的主要因子之一，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞前體分化為成肌纖維細(xì)胞并促使其增殖［3］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種多功能血管生成調(diào)節(jié)劑，在哮喘患者中呈過(guò)表達(dá)，且其表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，與支氣管直徑和氣道高反應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)［4］。VEGF和TGF-β1均是氣道重塑的經(jīng)典標(biāo)志物。氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞中氣道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞均是白介素13（interleukin 13，IL-13）的靶細(xì)胞，故IL-13在氣道重塑中起關(guān)鍵作用［5］。內(nèi)皮素1（endothelin1，ET-1）作為一種具有促進(jìn)生長(zhǎng)特性的有效支氣管收縮劑和內(nèi)源性血管收縮劑肽，可參與香煙煙霧引起的血管和氣道高反應(yīng)［6］。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，ET-1會(huì)影響鼠哮喘模型的氣道重塑［7］。三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水解后鈉泵會(huì)將3個(gè)胞內(nèi)鈉離子交換兩個(gè)胞外鉀離子［8］。研究表明，許多與Na+-K+-ATP酶相互作用的化合物可緩解急性或慢性哮喘患者的臨床癥狀［9］。層粘連蛋白α4（LAMα4）普遍存在于內(nèi)皮基底膜中。T淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的外滲主要發(fā)生在高表達(dá)LAMα4的部位，表明LAMα4可能會(huì)促進(jìn)外滲。鈉鉀泵Scr復(fù)合體亦稱琥珀酸-細(xì)胞色素c氧化還原酶，其是由復(fù)合體Ⅱ和復(fù)合體Ⅲ組成。本研究旨在探究鈉鉀泵Scr復(fù)合體對(duì)幼年哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的影響及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019年7月—2020年8月。從軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)120只8周齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量為110～130 g，放置在沒(méi)有特定病原體、溫度和濕度可控的環(huán)境中，大鼠可隨意進(jìn)水和食物。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 將120只SD雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組和治療組，每組40只。對(duì)照組大鼠于實(shí)驗(yàn)第1天腹腔注射5%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）1 μl+氯化鈉溶液 100 μl。哮喘組大鼠先制備哮喘模型［10］，具體如下：實(shí)驗(yàn)第1天和第14天，腹膜注射乳化的卵清蛋白（OVA，Ⅴ級(jí)）100 μg致敏；實(shí)驗(yàn)第25～27天，通過(guò)大鼠鼻內(nèi)遞送OVA 100 μg+PBS 50 μl。造模成功后，腹腔注射二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）1 μl+氯化鈉溶液100 μl。治療組大鼠先制備哮喘模型，方法同哮喘組，造模成功后給予鈉鉀泵Scr復(fù)合體藥物（Sigma公司生產(chǎn)），具體用法：鈉鉀泵Scr復(fù)合體藥物0.3 mg/kg溶解在20 mg/ml的DMSO中，并采用PBS稀釋至1 ml，腹腔注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（即實(shí)驗(yàn)第28天）檢測(cè)三組大鼠相關(guān)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR） 使用TRIzol試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20190258A）從肺組織中提取總RNA，并采用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq?一式三份進(jìn)行qPCR。熱循環(huán)條件：95 ℃變性 1 min，60 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 10 s，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法 使用放射免疫沉淀測(cè)定法（RIPA）裂解緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：201801102D）從肺組織中提取蛋白質(zhì)。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠上通過(guò)電泳分離總蛋白60 μg，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（Millipor公司，美國(guó)），在室溫下用含TBST的5%脫脂奶粉封閉1 h。膜與一抗在4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，與辣根過(guò)氧化物酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20180112D）偶聯(lián)的抗兔二抗〔1∶5 000；安諾倫（北京）生物科技有限公司生產(chǎn)〕在室溫下孵育1 h。使用Fusion Fx7圖像采集系統(tǒng)（Vilber Lourmat公司，法國(guó)），通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光試劑（Beyotime生物技術(shù)研究所）捕獲化學(xué)發(fā)光圖像，使用Image J軟件通過(guò)光密度測(cè)定法定量測(cè)定肺組織Scr及LAMα4相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 肺組織病理學(xué)檢查 支氣管肺泡灌洗后獲得完整的左肺，并在4%的低聚甲醛中固定24 h。將樣品脫水并包埋在石蠟中，切成4 μm的組織切片。分別采用蘇木素-伊紅（HE）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20180560M）、高碘酸-席夫（PAS）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20190956X）染色并分析切片。HE染色用于評(píng)估支氣管周?chē)脱苤車(chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)情況，PAS染色用于評(píng)估杯狀細(xì)胞增殖情況。由兩名對(duì)實(shí)驗(yàn)不知情的觀察員評(píng)估肺組織炎癥病變程度，肺組織炎癥病變程度由輕到重分為4級(jí)，分別記為0～3分［11］，其中無(wú)炎癥為0級(jí)（記為0分），偶有炎性細(xì)胞套扎為1級(jí)（記為1分），大多數(shù)支氣管或血管被薄層包圍為2級(jí)（記為2分），大多數(shù)支氣管或血管有一層較厚的炎性細(xì)胞為3級(jí)（記為3分）。如果炎癥病變程度為2～3級(jí)，則增加0.5分，支氣管周?chē)脱苤車(chē)谓M織炎癥評(píng)分之和為肺組織炎癥評(píng)分。使用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量PAS陽(yáng)性面積占比。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC） 采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法染色，每個(gè)載玻片隨機(jī)選擇3個(gè)視野（×250），使用具有Image-pro Plus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)的Olympus Cx31顯微鏡（Olympus公 司， 日 本） 定量測(cè)定 TGF-β1（ 抗 TGF-β1，1∶100稀釋；上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20190523B）和VEGF（抗VEGF，1∶100稀釋；上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20190630K）表達(dá)量。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 采用ELISA試劑盒（eBioscience公司，美國(guó)）定量檢測(cè)肺組織中IL-13、ET-1含量，并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（美國(guó)IBM公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織 Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr、LAMα4相對(duì)表達(dá)量 三組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr及LAMα4相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘組和治療組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，LAMα4相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr相對(duì)表達(dá)量高于哮喘組，LAMα4相對(duì)表達(dá)量低于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr及LAMα4相對(duì)表達(dá)量比較（± s）Table 1 Comparison of relative expression levels of Na+-K+-ATPase，Ca2+-ATPase，Scr and LAMα4 in lung tissue among the three groups

表1 三組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr及LAMα4相對(duì)表達(dá)量比較（± s）Table 1 Comparison of relative expression levels of Na+-K+-ATPase，Ca2+-ATPase，Scr and LAMα4 in lung tissue among the three groups

注：ATP=三磷酸腺苷，LAMα4=層粘連蛋白α4；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) Na+-K+-ATP酶 Ca2+-ATP酶 Scr LAMα4對(duì)照組 40 1.83±0.14 2.55±0.24 4.78±0.32 1.89±0.14哮喘組 40 0.66±0.12a 0.89±0.13a1.55±0.13a 8.47±0.26a治療組 40 1.64±0.13ab 2.18±0.24ab3.47±0.28ab4.11±0.36ab F值 17.292 13.171 13.907 13.748 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 肺組織炎癥評(píng)分和PAS陽(yáng)性面積占比 三組大鼠肺組織炎癥評(píng)分和PAS陽(yáng)性面積占比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘組和治療組大鼠肺組織炎癥評(píng)分高于對(duì)照組，PAS陽(yáng)性面積占比大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組大鼠肺組織炎癥評(píng)分低于哮喘組，PAS陽(yáng)性面積占比小于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。與對(duì)照組大鼠相比，哮喘組大鼠細(xì)支氣管周?chē)脱苤車(chē)嬖诟嗟难仔约?xì)胞浸潤(rùn)及大量的杯狀細(xì)胞，治療組較哮喘組大鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及杯狀細(xì)胞減少，見(jiàn)圖1。

圖1 三組大鼠肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果（×200）Figure 1 Pathological examination results in lung tissue of the three groups

表2 三組大鼠肺組織炎癥評(píng)分和PAS陽(yáng)性面積占比比較（±s）Table 2 Comparison of inflammation score and PAS positive area in lung tissue among the three groups

表2 三組大鼠肺組織炎癥評(píng)分和PAS陽(yáng)性面積占比比較（±s）Table 2 Comparison of inflammation score and PAS positive area in lung tissue among the three groups

注：PAS=高碘酸-席夫；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) 炎癥評(píng)分（分） P A S陽(yáng)性面積占比（%）對(duì)照組 4 0 0.5 3±0.0 6 0.8 8±0.2 1哮喘組 4 0 2.8 7±0.1 2 a 6.7 8±0.3 4 a治療組 4 0 1.3 5±0.1 7 ab 4.2 3±0.2 6 ab F值 1 2.7 3 8 1 2.7 3 8 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1

2.3 肺組織TGF-β1和VEGF表達(dá)情況 三組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘組和治療組大鼠肺組織中TGF-β1和VEGF表達(dá)高于對(duì)照組，治療組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達(dá)低于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖2。

圖2 三組大鼠肺組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（SP染色，×200）Figure 2 Immunohistochemical results in lung tissue of the three groups

表3 三組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達(dá)比較（±s）Table 3 Comparison of expression level of TGF-β1 and VEGF in lung tissue among the three groups

表3 三組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達(dá)比較（±s）Table 3 Comparison of expression level of TGF-β1 and VEGF in lung tissue among the three groups

注：TGF-β1=轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，VEGF=血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) T G F-β 1 V E G F對(duì)照組 4 0 3.4 7±0.3 2 2.7 8±0.1 1哮喘組 4 0 1 1.5 7±1.1 3 a 8.9 8±0.2 3 a治療組 4 0 6.3 4±0.1 8 ab 4.6 7±0.2 2 ab F值 1 4.8 2 9 1 6.2 8 9 P值 0.0 1 3 0.0 0 8

2.4 肺組織IL-13和ET-1 三組大鼠肺組織IL-13和ET-1比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘組和治療組肺組織大鼠IL-13和ET-1高于對(duì)照組，治療組大鼠肺組織IL-13和ET-1低于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 三組大鼠肺組織IL-13和ET-1比較（±s，pg/mg）Table 4 Comparison of IL-13 and ET-1 in lung tissue among the three groups

表4 三組大鼠肺組織IL-13和ET-1比較（±s，pg/mg）Table 4 Comparison of IL-13 and ET-1 in lung tissue among the three groups

注：IL-13=白介素13，ET-1=內(nèi)皮素1；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) IL-13 ET-1對(duì)照組 40 130.27±8.29 15.33±1.45哮喘組 40 324.66±14.82a 42.92±1.48a治療組 40 189.07±12.03ab 26.82±2.93ab F值 18.927 13.930 P值 0.016 0.007

3 討論

哮喘是一種慢性氣道炎性疾病，與氣道炎癥和氣道結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，而氣道炎癥和氣道重塑均可導(dǎo)致氣道高反應(yīng)。目前，支氣管哮喘的常見(jiàn)治療方法是吸入長(zhǎng)效β2-腎上腺素激動(dòng)劑和糖皮質(zhì)激素，以迅速緩解急性哮喘癥狀，減輕支氣管收縮和氣道炎癥，但部分患者對(duì)聯(lián)合用藥依從性較差或存在不良反應(yīng)。因此，尋找補(bǔ)充療法（尤其是植物療法）及有效控制氣道重塑的藥物已成為哮喘新的研究方向。

既往研究表明，Na+-K+-ATP酶活性藥物具有抑制哮喘的作用［12］，質(zhì)子泵抑制劑能有效緩解咳嗽癥狀［13］。體液和軸突的鈉泵會(huì)調(diào)節(jié)膜電位，而抑制其調(diào)節(jié)作用將會(huì)抑制動(dòng)作電位的產(chǎn)生。研究表明，鈉泵調(diào)節(jié)劑會(huì)選擇性作用于同工酶［14］。本研究結(jié)果顯示，哮喘組和治療組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，治療組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶相對(duì)表達(dá)量高于哮喘組，提示Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶表達(dá)下調(diào)可能與哮喘發(fā)生有關(guān)。

層粘連蛋白（LAM）是一組異源三聚體蛋白質(zhì)，由5個(gè)α、3個(gè)β、3個(gè)γ鏈組成，其與膠原蛋白Ⅳ、尼古丁和蛋白聚糖一起構(gòu)成了基底膜的主要功能成分。在健康肺組織中，LAMα2、α3、α5、β1、β2、β3、γ1及γ2存在于氣道上皮下的基底膜中，而LAMα4、β1、β2和γ1存在于氣道平滑肌基底膜中［15-16］。研究表明，氣道平滑肌質(zhì)量增加可能與氣道平滑肌細(xì)胞在增生和收縮表型之間轉(zhuǎn)換有關(guān)，暴露于增生刺激會(huì)誘導(dǎo)增生的氣道平滑肌表型［17］。本研究結(jié)果顯示，哮喘組和治療組大鼠肺組織LAMα4相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，治療組大鼠肺組織LAMα4相對(duì)表達(dá)量低于哮喘組。本研究結(jié)果還顯示，哮喘組和治療組大鼠肺組織炎癥評(píng)分高于對(duì)照組，PAS陽(yáng)性面積大于對(duì)照組；治療組大鼠肺組織炎癥評(píng)分低于哮喘組，PAS陽(yáng)性面積小于哮喘組，提示鈉鉀泵Scr復(fù)合體可有效減輕幼年哮喘大鼠氣道炎癥。

目前，鈉鉀泵在分子層面如何抵抗氣道重塑及涉及哪些下游分子和信號(hào)傳導(dǎo)途徑仍不清楚。氣道重塑的主要改變包括氣道上皮完整性破壞、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、新血管形成、血管重塑及黏液腺增生，尤其是氣道平滑肌細(xì)胞增生和肥大。研究表明，哮喘患者氣道平滑肌細(xì)胞數(shù)量異常增多，且其數(shù)量與哮喘持續(xù)時(shí)間及嚴(yán)重程度有關(guān)［18］。VEGF和TGF-β1均是氣道重塑的經(jīng)典標(biāo)志物。理論上講，氣道平滑肌質(zhì)量增加可通過(guò)細(xì)胞增殖、細(xì)胞肥大或兩者實(shí)現(xiàn)。IL-13是由活化的T細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞產(chǎn)生的Th2型細(xì)胞因子［19］，其是變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)的重要遞質(zhì)，可直接或單獨(dú)調(diào)節(jié)氣道平滑肌細(xì)胞，而不依賴于炎性反應(yīng)，其在氣道平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮和上皮細(xì)胞誘導(dǎo)的氣道重塑中起關(guān)鍵作用。ET-1是氣道平滑肌細(xì)胞的促分裂原和收縮激動(dòng)劑，支氣管肺泡液中ET-1水平升高與氣道高反應(yīng)和哮喘嚴(yán)重程度有關(guān)。機(jī)械壓縮支氣管上皮細(xì)胞有助于氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和基礎(chǔ)收縮，而增強(qiáng)的增殖和收縮取決于上皮細(xì)胞衍生的ET-1。本研究結(jié)果顯示，哮喘組和治療組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達(dá)高于對(duì)照組，治療組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達(dá)低于哮喘組；哮喘組和治療組大鼠肺組織IL-13和ET-1高于對(duì)照組，治療組大鼠肺組織IL-13和ET-1低于哮喘組，提示鈉鉀泵Scr復(fù)合體可抑制TGF-β1、VEGF、IL-13、ET-1釋放，進(jìn)而抑制氣道重塑。

綜上所述，鈉鉀泵Scr復(fù)合體可抑制幼年哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑，其機(jī)制可能與調(diào)控LAMα4表達(dá)及抑制TGF-β1、VEGF、IL-13和ET-1的釋放有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：黃河清進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，撰寫(xiě)并修訂論文，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；白燕進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析，結(jié)果分析與解釋。

本文無(wú)利益沖突。