黃 瑛，李小連，殷劍波，林永祺，彭小波，賈 彬

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋藻類生物工程技術(shù)研究中心，廣東深圳518060

三酰甘油(triacylglycerol, TAG)是自然界中脂肪的主要成分，其基本組成單位為脂肪酸(fatty acid, FA)，是生物柴油、食用油等油制品的組成成分．TAG的生物合成通路包括脂肪酸的合成途徑及肯尼迪途徑(Kennedy pathway)[1]．同時，TAG和FA的分解代謝產(chǎn)物也為脂肪的合成提供乙酰輔酶A．此外，脂肪代謝還與糖類和蛋白質(zhì)的代謝通過乙酰輔酶A、丙酮酸等中間代謝產(chǎn)物建立了緊密的聯(lián)系，形成復(fù)雜的碳氮代謝網(wǎng)絡(luò)．目前，單基因調(diào)控下提高工程藻株脂肪積累的研究已取得一定的進(jìn)展，長鏈酰基輔酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, LACS)參與FA的合成、活化與β-氧化，沉默cracs2基因后萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)的TAG質(zhì)量較野生型提高了55%[2].在三羧酸循環(huán)中，草酰乙酸和乙酰輔酶A在檸檬酸合酶(citrate synthase, CIS)的作用下形成檸檬酸，是關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)反應(yīng)．有研究表明，cis的沉默使得萊茵衣藻的TAG增加了169.5%[3].DOF(deoxyribonucleic acid binding with one finger)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)植物的種子萌發(fā)和碳氮代謝等代謝過程，在萊茵衣藻中過表達(dá)DOF轉(zhuǎn)錄因子后，胞內(nèi)總脂肪酸的含量為126.01 μg/mg，提高了23.24%[4]．但關(guān)于構(gòu)建多基因工程藻株以提高脂肪含量的報道較少，且對于碳氮代謝網(wǎng)絡(luò)中的脂肪合成調(diào)控機(jī)制有待深入研究．

萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii,C.reinhartii)為光合微藻中的模式生物，具有光合效率高、繁殖速度快、易于培養(yǎng)等優(yōu)勢，適合于構(gòu)建高產(chǎn)脂質(zhì)的工程藻株．轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是揭示基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有效手段[5-6]，萊茵衣藻的脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)錯綜復(fù)雜，且缺乏與調(diào)控機(jī)制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組信息，這有礙于相關(guān)基因的功能挖掘．本研究對3基因共調(diào)控下的萊茵衣藻藻株DLC(沉默acs2和cis1基因，且過表達(dá)DOF轉(zhuǎn)錄因子)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序以及差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)分析，進(jìn)一步揭示多基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下萊茵衣藻脂質(zhì)合成調(diào)控的分子機(jī)制，為提高微藻脂質(zhì)產(chǎn)量的基因調(diào)控工程提供理論基礎(chǔ)．

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與培養(yǎng)條件

萊茵衣藻C.reinhardtiiCC849購自美國衣藻資源中心．C.reinhartiiDLC藻株[7]來自深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)入了含acs2-cis1反向重復(fù)片段的pmaa7/XIR沉默載體，以及含dof表達(dá)片段(受RBCS2-HSP70A熱激啟動子調(diào)控)的pJD表達(dá)載體． 大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli) Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司．

利用三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽-磷酸培養(yǎng)基，將藻株于25 ℃、100 μmol/(m2·s)光照強(qiáng)度條件下培養(yǎng)．待培養(yǎng)至對數(shù)期，于水浴鍋中40 ℃熱激30 min，室溫下恢復(fù)1 h后提取總核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序．樣品組包括無熱激處理工程藻株(DLC)、野生型藻株(WT)、熱激處理工程藻株(HDLC)及熱激處理野生型藻株(HWT)，各組分別設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)．待繼續(xù)培養(yǎng)至第6天進(jìn)行TAG及淀粉的檢測．

1.2 TAG含量的檢測

BODIPY 505/515為油脂熒光染料，其與藻細(xì)胞內(nèi)的脂滴結(jié)合后在激光照射下發(fā)綠色熒光，故熒光強(qiáng)度的高低直接反映胞內(nèi)TAG的含量，檢測過程為：① 取1.5 mL的藻液，于5 000 r/min離心5 min回收藻細(xì)胞；② 用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)(0.01 mol/L)沖洗2～3 遍后，4 000 r/min離心2 min；③ 通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用PBS將體系稀釋至2×106～6×106/mL；④ 取980 μL的稀釋藻液至流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)的細(xì)胞管中，再取20 μL含10 μg/mL BODIPY 505/515 染液(Thermo Fisher Scientific)的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶液加入；⑤ 以不加染液的藻液為陰性對照，在異硫氯熒光素(fluoresceinisothiocyanate, FITC)通道中，激發(fā)光480 nm、發(fā)射光510 nm下對1×105個細(xì)胞進(jìn)行熒光值讀數(shù)．

1.3 淀粉含量的測定

① 取5 mL藻液離心(12 000 r/min，10 min)，棄上清；② 取700 μL經(jīng)淀粉提取試劑盒(Solarbio)提取后的提取液，加入100 μL蒸餾水稀釋8倍；③ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：采用酶標(biāo)儀分別檢測0.2、 0.1、 0.05、 0.025、 0.012 5、0.006 25、0.003 125及0.001 56 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在620 nm處的吸光度；以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此得到線性函數(shù)方程；④ 在樣品測量前先檢測標(biāo)準(zhǔn)品以校正：混合0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液與1 mL 淀粉提取劑，95 ℃下水浴加熱10 min，待冷卻后以同體積蒸餾水的吸光度為空白對照值,分別測定標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度,并與據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)計(jì)算出的葡萄糖濃度進(jìn)行比較校準(zhǔn)；⑤ 測定各組樣品提取液在620 nm處的吸光度，將依照標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)計(jì)算所得的淀粉質(zhì)量濃度ρ值(單位：mg/mL)代入式(1),即可計(jì)算出各樣品(鮮質(zhì)量)中的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)w(單位：mg/g).

w=ρVn/m

(1)

其中，V為稀釋后淀粉提取液的體積(單位： mL)；m為樣品藻細(xì)胞的鮮質(zhì)量(單位： g);n為稀釋倍數(shù)．

1.4 總RNA的提取與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲取

利用RNAiso Plus(Takara)試劑盒提取各組樣品的總RNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific)測定RNA濃度和純度，以及質(zhì)量濃度為10 g/L的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA的質(zhì)量后，構(gòu)建互補(bǔ)核糖核酸(complementary dexyribonucleic acid, cDNA)文庫，并委托華大基因測序，每個樣品組分別進(jìn)行3次重復(fù)測序．

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

1.5.1 原始數(shù)據(jù)處理及參考基因組比對

文庫測序完成后得到原始數(shù)據(jù)(raw reads)，通過SOAP nuke軟件(v 1.4.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并使用軟件Trimmomatic(v 0.36)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，排除帶有測序接頭、未知堿基數(shù)量大于5%和質(zhì)量低的數(shù)據(jù)(reads)，得到過濾后數(shù)據(jù)(clean reads)；利用HISAT2 軟件[8](v 2.1.0)與參考基因組進(jìn)行比對，使用Bowtie2軟件[9](v 2.2.5)與參考基因比對，采用RNA-seq by expectation maximization(RSEM)軟件包[10](v 1.2.8)計(jì)算基因表達(dá)豐度，并以FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)表示．

1.5.2 差異表達(dá)基因的篩選與富集分析

使用華大基因Dr.Tom系統(tǒng)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，設(shè)定差異表達(dá)倍數(shù)(fold change)≥ 2、Q值(校正后的P值)≤0.001， 得到初步的DEGs；再進(jìn)一步篩選HWT藻株中FPKM值大于等于1.5的DEGs，并據(jù)京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)的注釋結(jié)果及官方分類對DEGs進(jìn)行通路聚類及富集分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 TAG及淀粉含量的變化

經(jīng)BODIFY 505/515染色法檢測，發(fā)現(xiàn)DLC藻株的熒光強(qiáng)度較WT藻株升高了70%(圖1)，且HDLC藻株的熒光強(qiáng)度較HWT藻株提高了118%，說明3基因的共調(diào)控能促進(jìn)萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)的TAG合成． HDLC藻株的熒光強(qiáng)度較DLC藻株提高了77%，且HDLC藻株的熒光強(qiáng)度較WT藻株提高了193%，說明熱激誘導(dǎo)進(jìn)一步增強(qiáng)dof基因的過表達(dá)后，3基因的共調(diào)控使得萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成進(jìn)一步顯著增強(qiáng)．

**為P< 0.01, t 檢驗(yàn) (n=3)圖1 萊茵衣藻內(nèi)TAG含量的變化Fig.1 TAG content of C.reinhardtii

DLC與WT藻細(xì)胞中的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為122.99 mg/g和134.29 mg/g，二者無顯著性差異，但HDLC藻株中的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)比HWT藻株的少了30%(圖2)，而HDLC藻株中的脂質(zhì)質(zhì)量較高，說明3基因共調(diào)控藻株中的碳流發(fā)生了重新定向，使得糖類合成通路中的代謝物流向脂質(zhì)合成通路中被利用．

2.2 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)

將WT、HWT和HDLC三組藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行比對．WT與HWT、HWT與 HDLC兩組之間統(tǒng)計(jì)得1 665個共同的DEGs，其中，F(xiàn)PKM值≥1.5的DEGs有749個，543個為上調(diào)基因，206個為下調(diào)基因．

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG聚類與富集分析

差異表達(dá)基因的KEGG pathway分類結(jié)果如圖3，分別有51個和15個DEGs參與碳水化合物代謝與脂質(zhì)代謝．

進(jìn)一步對這兩種代謝途徑中的DEGs進(jìn)行富集分析，結(jié)果如圖4．由圖4可見，在碳水化合物代謝中，富集在糖酵解及糖異生的DEGs編碼乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸激酶和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶等；富集在淀粉與蔗糖代謝的DEGs編碼內(nèi)切葡聚糖酶、1, 3-β-葡聚糖合酶和果膠酯酶等；此外，還有DEGs富集在三羧酸循環(huán)和光合有機(jī)體中的碳固定等代謝過程．

圖3 差異基因的KEGG聚類分析Fig.3 KEGG pathway classification of differentially expressed genes

圖4 差異基因在碳水化合物代謝通路中的富集分析Fig.4 Enrichment analysis of differentially expressed genes in carbohydrate metabolism

由圖5可見，在脂質(zhì)代謝過程中，富集在甘油三酯代謝的DEGs編碼醇脫氫酶等；富集在甘油磷脂代謝的DEGs編碼溶血磷脂酶Ⅱ和乙醇胺-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶等；富集在脂肪酸降解的DEGs編碼乙酰輔酶A-乙?；D(zhuǎn)移酶和?；o酶A氧化酶Ⅰ等；還有DEGs富集在脂肪酸碳鏈延伸過程．通路中富集的關(guān)鍵DEGs的分布及其注釋信息如表1，其中，N為差異倍數(shù)．

圖5 差異基因在脂質(zhì)代謝通路中的集分析Fig.5 Enrichment analysis of differentially expressed genes in lipid metabolism

表1 脂質(zhì)及碳水化合物代謝途徑中關(guān)鍵差異表達(dá)基因的注釋

上述脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步表明3基因調(diào)控下萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的增加，不僅是由于脂質(zhì)合成代謝的增強(qiáng)，還可能是因?yàn)楦视王ズ椭舅峤到獾纫灾|(zhì)為起始反應(yīng)物的途徑被弱化．此外，還可能是由于糖類等其他非脂物質(zhì)的生物合成途徑減弱，使得更多的共同代謝中間物流向脂質(zhì)合成途徑而被充分利用．

3 討 論

脂質(zhì)合成代謝中的甘油三酯代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝等途徑與糖代謝中的糖酵解、糖異生和淀粉代謝等途徑相關(guān)聯(lián)，因此，若其他代謝通路含有生成三磷酸甘油、甘油、乙酰輔酶A和脂肪酸等共同中間代謝產(chǎn)物，則能在一定的調(diào)控條件下改變碳流的偏向，促進(jìn)脂質(zhì)合成代謝． ACS2和CIS1分別參與脂質(zhì)合成及糖代謝中的關(guān)鍵反應(yīng)，而DOF轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)碳氮代謝中多通路的調(diào)控，則3基因的共同調(diào)控定能引起其他關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化．

在甘油三酯代謝中， 醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)能將甘油氧化為D-甘油醛，再被甘油脫氫酶催化為甘油．有研究表明，編碼ADH及乙酰乙酸脫羧酶等參與乙酰輔酶A代謝的基因的共同過表達(dá)導(dǎo)致大腸桿菌內(nèi)的脂肪酸異丙基酯達(dá)203.4 mg/L[11]．與WT藻細(xì)胞相比，ADH在HWT 藻細(xì)胞中的表達(dá)水平下降；而相比于HWT藻細(xì)胞，ADH在HDLC中表達(dá)水平上調(diào)，說明3基因調(diào)控下ADH的上調(diào)可能導(dǎo)致甘油的增加而增強(qiáng)脂質(zhì)合成代謝．

在甘油磷脂代謝中，三磷酸甘油是重要的中間產(chǎn)物．相較HDLC藻細(xì)胞中溶血磷脂酶Ⅱ(lysophospholipase Ⅱ, LYPLA2)及乙醇胺-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶2(phosphate cytidylyltransterase 2, PCYT2)的表達(dá)量增加，LYPLA2以2-?；视?3-磷酸膽堿為底物，催化生成甘油-3-磷酸膽堿，隨后被轉(zhuǎn)化為三磷酸甘油；而PCYT2將磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)化為CDP-乙醇胺，產(chǎn)物經(jīng)接連反應(yīng)后被轉(zhuǎn)化為三磷酸甘油．WEPY等[12]發(fā)現(xiàn)LYPLA1和LYPLA2共同調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞脂質(zhì)代謝的平衡，任何一方的活性缺失均會導(dǎo)致溶血磷脂的增加；PAVLOVIC等[13]則發(fā)現(xiàn)pcyt2的沉默導(dǎo)致小鼠胚胎細(xì)胞內(nèi)磷脂酰乙醇胺合成的提高，使得膜脂增加．因此，熱激后3基因的調(diào)控下LP2、 PCYT2的表達(dá)上調(diào)可能抑制膜脂的合成,使得脂質(zhì)的生物合成進(jìn)程偏向三酰甘油的合成．

在脂肪酸降解途徑中，乙酰輔酶A是由脂肪酸β-氧化和糖酵解終產(chǎn)物丙酮酸經(jīng)氧化脫羧產(chǎn)生的，在有機(jī)體中的許多代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用．β-氧化的連續(xù)周期反應(yīng)過程中，每一步反應(yīng)中長鏈脂肪酸脫去含兩個碳原子的碎片而被氧化為逐縮短碳鏈的脂酰輔酶A，從而產(chǎn)生乙酰輔酶A[14]．相比HWT藻細(xì)胞，HDLC藻細(xì)胞中?；o酶A氧化酶1(acyl-CoA oxidase, ACOX1)和乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶(acyl-CoA acyltransferase, ACAT)的表達(dá)量上調(diào)． ACOX1參與多種堿基輔酶A的氧化反應(yīng)，促進(jìn)脂肪酸的氧化分解[15]；而ACAT催化短鏈脂肪酸的氧化反應(yīng)，生成乙酰輔酶A[16]．故而兩個基因的上調(diào)表達(dá)可能一定程度上促進(jìn)脂肪酸的氧化分解，加快乙酰輔酶A 循環(huán)流的流動，進(jìn)而提高脂肪酸合成的中間產(chǎn)物循環(huán)效率．

丙酮酸既是糖酵解途徑的終產(chǎn)物，也為糖異生途徑的起始反應(yīng)物．作為乙酰輔酶A的合成前體，丙酮酸與脂質(zhì)合成代謝有著緊密的聯(lián)系．在糖酵解及糖異生代謝中，相較于HWT藻細(xì)胞，HDLC藻細(xì)胞中的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphcrte isomerases, G6PI)、 丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)及乙酰輔酶A合成酶(acyl-CoA synthetase, ACS)表達(dá)水平更高．G6PI催化α-D-6-磷酸葡萄糖和β-D-6-磷酸葡萄糖間的相互轉(zhuǎn)變，及兩者向β-D-6-磷酸果糖的轉(zhuǎn)變．β-D-6-磷酸果糖繼而在相關(guān)酶作用下的產(chǎn)物為磷酸烯醇丙酮酸，接而經(jīng)PK產(chǎn)生丙酮酸．另一方面，乙醇被氧化為乙醛、醋酸后，經(jīng)ACS合成乙酰輔酶A．有報道表明， 敲除編碼G6PI的基因后，鼠細(xì)胞中甘油酯含量減少，且油脂代謝中的磷脂酸磷酸酶Ⅰ基因也隨之出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)[17]；在萊茵衣藻中過表達(dá)ACS2后，導(dǎo)致葉綠體中碳流向乙酰輔酶A合成的方向富集，從而使得三酰甘油含量提高了2.4倍[18]．G6PI、 PK及ACS的表達(dá)上調(diào)可能通過增加丙酮酸、乙酰輔酶A的含量以增強(qiáng)脂質(zhì)合成代謝．

在淀粉代謝中，α-D-葡萄糖-1-磷酸為重要的代謝中間物質(zhì)，磷酸葡萄糖變位酶能將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，即丙酮酸的前體．相比HWT藻株，HDLC藻株中內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1, 4-β-D-glucanohydrolase, EGA)、 葡聚糖合酶(glucan synthase, BGS)和果膠酯酶(pectinesterase, PA)均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)．PA促進(jìn)ADP-葡萄糖(由α-D-葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化而來)生成直鏈淀粉；BGS利用α-D-葡萄糖-1-磷酸合成1，3-β-D葡聚糖，繼而被轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖；EGA則利用以α-D-葡萄糖-1-磷酸為底物合成的纖維素，合成纖維糊精，而后經(jīng)系列反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)镈-葡萄糖．淀粉代謝途徑中3個關(guān)鍵DEGs的下調(diào)可能抑制消耗α-D-葡萄糖-1-磷酸的反應(yīng)過程，間接等導(dǎo)致丙酮酸含量的增加，從而使得碳流定向于脂質(zhì)合成代謝．

結(jié) 語

沉默acs2和cis1基因且過表達(dá)DOF轉(zhuǎn)錄因子的3基因共調(diào)控重定向碳氮代謝中的碳流流向，增強(qiáng)了脂質(zhì)合成代謝，為萊茵衣藻脂質(zhì)合成代謝機(jī)制研究提供了理論參考，為研究微藻細(xì)胞代謝定向調(diào)控提供方法．針對以上差異基因富集的代謝通路，后續(xù)將對構(gòu)建的高油脂藻株進(jìn)行深入的油脂代謝轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌機(jī)制的研究．