王鑫

【摘要】 背景 骨性關(guān)節(jié)炎（OA）在我國患病率約為8.1%，是一種嚴重影響患者生活質(zhì)量的關(guān)節(jié)退行性疾病，OA的診斷目前多依賴于病史、體征及影像學(xué)改變等，因此，探索血清學(xué)改變有助于OA的早期診療與預(yù)后。目的 研究血漿可溶性信號素4D（Sema4D）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）含量與老年膝骨性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性，評價血漿可溶性Sema4D和MMP-9對老年膝骨性關(guān)節(jié)炎診斷的參考價值及其對評價骨關(guān)節(jié)炎嚴重程度的臨床價值。方法? 選取2020年12月至2021年4月因骨關(guān)節(jié)炎就診于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院（第九四〇醫(yī)院）的擬行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者32例為實驗組;同期于第九四〇醫(yī)院行健康體檢的21例為對照組。使用酶聯(lián)免疫吸附法分別測定實驗組及對照組血漿可溶性Sema4D和MMP-9濃度，同時根據(jù)指南對實驗組進行HSS評分及Kellgren & Lawrence分級。結(jié)果膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血漿可溶性Sema4D和MMP-9濃度均高于健康對照組，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血漿Sema4D濃度及MMP-9水平與HSS評分呈負相關(guān)，與Kellgren & Lawrence分級呈正相關(guān)。結(jié)論膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血漿可溶性Sema4D和MMP-9均升高，血漿可溶性Sema4D和MMP-9均對膝骨性關(guān)節(jié)炎的診斷具有參考價值;血漿可溶性Sema4D和MMP-9濃度水平與HSS評分呈負相關(guān)，與Kellgren & Lawrence分級呈正相關(guān)，表明其對評價老年膝骨性關(guān)節(jié)炎嚴重程度具有臨床價值。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;信號素4D;基質(zhì)金屬蛋白酶-9

中圖分類號：R684.3

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種關(guān)節(jié)軟骨的退行性疾病，其病因尚不清楚。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與年齡、肥胖、炎癥疾病、創(chuàng)傷和遺傳因素等有關(guān)。其病理特征為關(guān)節(jié)軟骨退行性變，軟骨下骨硬化或囊性變，關(guān)節(jié)邊緣骨增生，滑膜病變，關(guān)節(jié)囊攣縮，韌帶松弛或攣縮，肌肉萎縮無力等。根據(jù)中國健康與養(yǎng)老追蹤調(diào)查數(shù)據(jù)庫的研究結(jié)果顯示[1]，我國癥狀性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（膝關(guān)節(jié)Kellgren & Lawrence分級≥II級，同時存在膝關(guān)節(jié)疼痛）的患病率為8.1% [2]。隨著我國人口老齡化和肥胖人數(shù)的不斷增加，骨關(guān)節(jié)炎的老年患病率正在不斷增加。這從一定程度上給個人和社會導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟負擔(dān)，及時診斷及治療骨關(guān)節(jié)炎已刻不容緩。信號素（Semaphorins）最初被定義為神經(jīng)導(dǎo)向蛋白，信號素蛋白家族由20多種蛋白質(zhì)組成，根據(jù)其結(jié)構(gòu)及特征分為八個亞類。最近對信號素的研究表明，這些蛋白質(zhì)可能發(fā)揮多種作用，包括調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[3-4]、血管生成[5-6]、腫瘤轉(zhuǎn)移[7-8]和骨代謝[9-11]。目前已有研究證實Sema4d基因敲除明顯阻止了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中的骨丟失，Sema4D與其受體叢蛋白B1（Plexin-B1）在成骨細胞上的結(jié)合引起GTP酶的激活RhoA，通過抑制胰島素樣生長因子-1（IGF-1）信號，調(diào)節(jié)成骨細胞來抑制骨形成，這表明Sema4d是一種破骨細胞表達信號蛋白[12]。在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制中，其中一條主要機制即是關(guān)節(jié)細胞外基質(zhì)（ECM）的過度降解。ECM 主要由II型膠原和蛋白聚糖聚合物組成，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）參與II型膠原和蛋白聚糖聚合物的降解[13]?；|(zhì)金屬蛋白酶的激活導(dǎo)致導(dǎo)致關(guān)節(jié)ECM過度降解，從而參與骨關(guān)節(jié)炎的病理過程。本研究通過檢測骨關(guān)節(jié)炎血漿中可溶性Sema4D和MMP-9的濃度，探討血漿可溶性Sema4D和MMP-9濃度作為老年膝骨性關(guān)節(jié)炎及其嚴重程度評估指的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組

選取選取2020年12月至2021年4月因骨關(guān)節(jié)炎就診于第九四〇醫(yī)院擬行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者32例為實驗組，其中男性14例，女性18例，平均年齡62.59±9.12歲;同期就診行健康體檢的人員21例為對照組，近期均無急慢性病史，入院常規(guī)檢查無異常。其中男性13例，女性8例，平均年齡59.43±7.46歲。本研究已取得患者與患者家屬的知情同意且獲得第九四〇醫(yī)院科研倫理委員會批準。

1.2 標本收集及處理

所有研究對象均采集入院第二天清晨空腹肘靜脈血 8ml，4ml 分裝于EDTA抗凝管中，于第九四〇醫(yī)院檢驗科檢測血常規(guī)、ESR（紅細胞沉降率）、C反應(yīng)蛋白、AST（天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、Scr（肌酐）、BUN（尿素氮），4ml 分裝于EDTA抗凝管中，放入第九四〇醫(yī)院骨科研究所（以下簡稱骨研所）實驗室低溫高速離心機中，在-4℃、3000轉(zhuǎn)條件下離心10分鐘取上清，取得的血漿標本存放于-80攝氏度冰箱內(nèi)，檢測時統(tǒng)一復(fù)融。

1.3 血漿可溶性Sema4D與MMP-9濃度的測定

采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被Sema4D、MMP-9抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP 標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物 TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Sema4D、MMP-9呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

檢測步驟：1.人可溶性 Sema4D 、MMP-9ELISA 檢測試劑盒保存在骨研所-4℃冰箱內(nèi)，使用前從室溫平衡 20min后的鋁箔袋中取出所需板條，蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水;2.設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50μL;3.樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體 100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育 60min;5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次;6. 每孔加入底物溶液各50μL，37℃避光孵育15min;7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值;8.繪制標準曲線：以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

1.4 統(tǒng)計分析

本研究采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗或方差分析。不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用卡方檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本臨床資料的對比

骨關(guān)節(jié)炎組與同年齡組健康人群對照組在年齡、性別、血常規(guī)、ESR、C反應(yīng)蛋白、AST、ALT、Scr、BUN水平等基礎(chǔ)臨床資料項目的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表1）。

2.2兩組間血漿Sema4D濃度、MMP-9濃度的比較

老年膝骨性關(guān)節(jié)炎患者組血漿可溶性Sema4D、MMP-9濃度高于對照組[11.71±1.53ng/mlvs10.11±2.49ng/ml，P<0.05;33.57±2.77ng/mlvs29.95±5.58，P<0.05]（見表2）。

2.3老年膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血漿可溶性 Sema4D 水平、MMP水平與HSS評分的相關(guān)性分析

將血漿可溶性 Sema4D MMP水平與HSS評分、Kellgren & Lawrence分級做 Spearman 相關(guān)性分析。血漿可溶性Sema4D和MMP-9濃度水平與HSS評分呈負相關(guān)，與Kellgren & Lawrence分級呈正相關(guān)。其中血漿可溶性Sema4D和MMP-9濃度水平呈正相關(guān)（r=0.547，P<0.05）;與HSS評分呈負相關(guān)（r=-0.845，P<0.05）;與Kellgren & Lawrence分級呈正相關(guān)（r=0.516，P<0.05）。MMP-9濃度水平與HSS評分呈負相關(guān)（r=-0.407，P<0.05）;與Kellgren & Lawrence分級呈正相關(guān)（r=0.387，P<0.05）（見表3）。

3.討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種關(guān)節(jié)軟骨的退行性疾病，軟骨、滑膜、韌帶及關(guān)節(jié)周圍肌肉均發(fā)生病理改變，其中最先發(fā)生的是關(guān)節(jié)軟骨的病理改變。關(guān)節(jié)軟骨破壞分解后分解產(chǎn)物被釋放入關(guān)節(jié)滑液，這些小顆粒被滑膜細胞吞噬，滑膜細胞通過血液循環(huán)及淋巴轉(zhuǎn)運出軟骨顆粒，導(dǎo)致滑膜炎進一步發(fā)展。滑膜細胞因炎癥激活后釋放可分解關(guān)節(jié)軟骨的蛋白酶及促炎介質(zhì)，而這些炎性細胞及參與關(guān)節(jié)軟骨的分解蛋酶的增多，使關(guān)節(jié)軟骨進一步破壞形成微小顆粒。這使得骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進入惡性循環(huán)[14]。關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥使得炎癥因子大量激活釋放，如白介素-1（IL-1）等，多種炎性介質(zhì)使得基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMP）比例失調(diào)，最終引起軟骨細胞外基質(zhì)降解[15]。MMP-9又稱明膠酶B，主要作用為降解細胞外基質(zhì)[16]，參與多種生理及病理過程。當關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥因子激活后，MMP-9大量釋放，降解軟骨基質(zhì)細胞，破壞軟骨結(jié)構(gòu)。Sema4D是最初被發(fā)現(xiàn)在免疫細胞上表達的信號素，參與多種炎癥因子介導(dǎo)的疾病。當炎癥細胞激活后，其釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶可以切割Sema4D，使有活性的可溶性Sema4D釋放入血，可溶性Sema4D與其相應(yīng)的受體結(jié)合，參與免疫反應(yīng)[17]。Sema4D最近是信號素家族的成員，目前已發(fā)現(xiàn)在免疫反應(yīng)中具有重要作用，一旦Sema4D在炎癥中被激活，分子量為120 kDa的可溶性Sema4D便從細胞膜上脫落并可在循環(huán)血液中檢測到。目前多項研究均證實了Sema4D參與多種慢性炎癥反應(yīng)性疾病[18，19]。有研究發(fā)現(xiàn)破骨細胞中Sema4D的表達抑制了骨形成并且Sema4D通過其對生殖功能的影響間接調(diào)節(jié)骨吸收[20]。本文納入因膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎入院的患者，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者血漿可溶性Sema4D和MMP-9濃度，與健康體檢者對照，二者濃度均明顯升高，且血漿可溶性Sema4D和MMP-9濃度水平與HSS評分呈負相關(guān)，與AKellgren & Lawrence分級呈正相關(guān)。該結(jié)果表明血漿可溶性Sema4D和MMP-9濃度與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎及其嚴重程度均具有相關(guān)性。表明對骨性關(guān)節(jié)炎的診斷具有一定的參考價值，且對評價骨關(guān)節(jié)炎嚴重程度具有一定的臨床價值。既往有研究證實骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的進行性軟骨破壞是基質(zhì)金屬蛋白酶活性增強的結(jié)果，該研究發(fā)現(xiàn)在大鼠右膝半月板撕裂模型中，每天兩次以25mg/kg的劑量口服MMPI可顯著抑制軟骨退化和骨贅形成，故MMP的抑制作用能有效地減輕關(guān)節(jié)損傷，該研究亦反映出基質(zhì)金屬蛋白酶在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[21]。陳德勝等通過觀察人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨中的MMP-9、VEGF表達升高，發(fā)現(xiàn)其與膝關(guān)節(jié)軟骨退行性病變有關(guān)[22]。Takako 等通過動物模型研究發(fā)現(xiàn)抑制Sema4D–叢蛋白B1–RhoA信號軸可作為治療骨關(guān)節(jié)疾病，包括骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新途徑（Negishi-Koga T ，? Shinohara M ，? Komatsu N ， et al. Suppression of bone formation by osteoclastic expression of semaphorin 4D[J].）。目前的研究已經(jīng)證實了MMP可作為切割 Sema4D 細胞外結(jié)構(gòu)域的第二種蛋白酶[23]，因此我們推測本研究中骨關(guān)節(jié)炎患者血漿可溶性Sema4D濃度較對照組高的原因可能與此有關(guān)。綜上所述，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生后，各種炎癥因子激活MMP-9釋放，引起關(guān)節(jié)軟骨破壞，而MMP-9將炎癥細胞中的Sema4D切割，從而將可溶性Sema4D釋放入血?？扇苄許ema4D及MMP-9可能成為診斷老年膝骨性關(guān)節(jié)炎的參考指標，且可通過二者血漿中濃度檢測骨關(guān)節(jié)炎的嚴重程度。

參考文獻

[1]楊帆. 中國健康與養(yǎng)老追蹤調(diào)查數(shù)據(jù)庫介紹[J]. 實證社會科學(xué)， 2017（1）.

[2]中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會關(guān)節(jié)外科學(xué)組. 骨關(guān)節(jié)炎診療指南（2018年版）[J]. 中華骨科雜志， 2018， 38（012）：705-715.

[3] Takamatsu H ， Kumanogoh A . Diverse roles for semaphorin-plexin signaling in the immune system.[J]. Trends in Immunology， 2012， 33（3）：127-135.

[4] Kumanogoh A ，? Kikutani H . Immunological functions of the neuropilins and plexins as receptors for semaphorins[J]. Nature Reviews Immunology， 2013， 13（11）：802-814.

[5] Vadasz Z ，? Attias D ，? Kessel A ， et al. Neuropilins and semaphorins - from angiogenesis to autoimmunity[J]. Autoimmunity Reviews， 2010， 9（12）：825-829.

[6] Gu C ，? Giraudo E . The role of semaphorins and their receptors in vascular development and cancer[J]. Experimental Cell Research， 2013， 319（9）：1306-1316.

[7] Rehman M ，? Tamagnone L . Semaphorins in cancer： Biological mechanisms and therapeutic approaches[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology， 2013， 24（3）：179-189.

[8] Rizzolio S ，? Tamagnone L . Semaphorin Signals on the Road to Cancer Invasion and Metastasis[J]. Cell adhesion & migration， 2007， 1（2）：62-68.

[9] Negishi-Koga T ，? Shinohara M ，? Komatsu N ， et al. Suppression of bone formation by osteoclastic expression of semaphorin 4D[J]. Nature Medicine， 2011， 17（11）：1473-1480.

[10]Mikihito， Hayashi， Tomoki， et al. Osteoprotection by semaphorin 3A[J]. Nature， 2012， 485（7396）：69-74.

[11]Sema3A regulates bone-mass accrual through sensory innervations.[J]. Nature， 2013， 497（7450）：490-493.

[12] Negishi-Koga T ，? Shinohara M ，? Komatsu N ， et al. Suppression of bone formation by osteoclastic expression of semaphorin 4D[J]. Nature Medicine， 2011， 17（11）：1473-1480.

[13] Wang Z ，? Xu M ，? Bai J ， et al. Vildagliptin reduced extracellular matrix degradation in human primary chondrocytes[J]. EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY， 2019.

[14] Sellam J ，? Berenbaum F . The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis.[J]. Nature Reviews Rheumatology， 2010， 6（11）：625.

[15] Wang Z ，? Xu M ，? Bai J ， et al. Vildagliptin reduced extracellular matrix degradation in human primary chondrocytes[J]. EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY， 2019.

[16] Vu T H ，? Werb Z . Vu TH & Werb Z. Matrix metalloproteinases： Effectors of development and normal physiology. Genes Dev14： 2123-2133 10.1101/gad.815400[J]. Genes & Development， 2000， 14（17）：2123-2133.

[17] Wang X ，? Kumanogoh A ，? Watanabe C ， et al. Functional soluble CD100/Sema4D released from activated lymphocytes： possible role in normal and pathologic immune responses[J]. Blood， 2001， 97（11）：3498-3504.

[18] Yoshida Y ，? Ogata A ，? Kang S ， et al. Semaphorin 4D Contributes to Rheumatoid Arthritis by Inducing Inflammatory Cytokine Production： Pathogenic and Therapeutic Implications[J]. Arthritis Rheumatol， 2015， 67（6）：1481-1490.

[19] Vadasz Z ， Toubi E . Semaphorins： Their Dual Role in Regulating Immune-Mediated Diseases[J]. Clinical Reviews in Allergy & Immunology， 2013， 47（1）：17-25.

[20] Dacquin R ，? Domenget C ，? Kumanogoh A ， et al. Control of Bone Resorption by Semaphorin 4D Is Dependent on Ovarian Function[J]. PLoS ONE， 2011， 6（10）：e26627-.

[21] F M J J A ， B A M B ， A K K B ， et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus： Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2002， 10（ 10）：785-791.

[22] 陳德勝， 張學(xué)森， 張晨，等. MMP-9和VEGF在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達及意義[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2020年42卷7期， 678-682頁， ISTIC， 2020.

[23] Basile J R ，? Holmbeck K ，? Bugge T H ， et al. MT1-MMP Controls Tumor-induced Angiogenesis through the Release of Semaphorin 4D[J]. Journal of Biological Chemistry， 2007， 282.