李美瑩，李 前，金子涵，劉春萍，陸秀君

(沈陽農(nóng)業(yè)大學 林學院，遼寧 沈陽 110866)

蒙古櫟Quercusmongolica是殼斗科Fagaceae櫟屬Q(mào)uercus落葉喬木，廣泛分布于寒溫帶、溫帶和暖溫帶[1]。蒙古櫟是國家二級珍貴樹種，同時也是我國東北地區(qū)主要的次生林樹種[2]。蒙古櫟具有很高的應(yīng)用價值，是我國主要的用材樹種之一；也可作為經(jīng)濟林樹種，木材可用來制作精美的葡萄酒桶[3]；同時蒙古櫟種實可提取單寧，具有良好的清熱解毒功效，藥用和食用價值較高[4]。

蒙古櫟生長周期長，結(jié)實晚，產(chǎn)量低，種子有大小年，良種匱乏。此外種子貯藏困難，容易受到多種昆蟲侵害，因此蒙古櫟種子園建立較為困難[5]。體細胞胚胎發(fā)生是木本植物大規(guī)模繁殖的重要方式之一[6]，具有繁殖速度快、數(shù)量多、能形成完整植株和再生率高等優(yōu)點[7]。近年來，關(guān)于櫟屬植株體細胞胚胎發(fā)生的報道有很多，Kim等[8]于1997年首次以生長在韓國的栓皮櫟Quercusvariabilis合子胚為外植體，成功誘導出體細胞胚。張存旭[9]在2003年以陜西省栓皮櫟天然林中的未成熟合子胚為外植體成功誘導出體細胞胚。2009年魏爽[10]以采集于沈陽農(nóng)業(yè)大學天柱山的遼東櫟Q.liaotungensis未成熟合子胚為外植體成功誘導出體胚。廖婧[11]以麻櫟成熟合子胚為外植體成功誘導出體細胞胚。張翠葉[12]以川滇高山櫟Q.aquifolioides未成熟合子胚為外植體成功進行體胚誘導。但目前沒有關(guān)于蒙古櫟體細胞胚胎發(fā)生形成再生植株及體細胞胚胎發(fā)生最佳培養(yǎng)條件的研究報道。

本文對蒙古櫟體細胞胚胎發(fā)生進行了初步研究，探究胚性愈傷組織的最佳誘導條件，旨在建立蒙古櫟體細胞胚胎發(fā)生體系，獲得蒙古櫟再生植株，為工廠化育苗等提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2017年、2018年的6月25日至9月10日，分別在沈陽農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)、遼寧省實驗林場(撫順清原灣甸子鎮(zhèn))地車溝工區(qū)采集優(yōu)良蒙古櫟植株的未成熟種子。采集的種子放入4 ℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1 初代培養(yǎng)

1.2.1.1 最佳取材時間的確定

2018年6月25日至9月10日，每15 d在同一株母樹采集未成熟種子，設(shè)置6種取材時間。采集的未成熟種子在流水下沖洗1 h后移至超凈臺。用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～5次，然后用0.1%升汞消毒12 min，并不斷地搖動瓶身，使外植體與消毒液充分接觸，最后用無菌水沖洗3～5次，用解剖刀切開種子，將下胚軸及胚根緊貼培養(yǎng)基的方式進行接種。啟動培養(yǎng)基選用MS+瓊脂6 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+水解酪蛋白0.5 g·L-1，添加激素2,4-D(0.1、0.5、1 mg·L-1)和6-BA(0、0.5、1、2 mg·L-1)。

1.2.1.2 適宜光照條件的篩選

將上述啟動培養(yǎng)材料分別設(shè)置光照培養(yǎng)16 h·d-1(光照強度2 000～3 000 lx)和全程暗培養(yǎng)。

1.2.1.3 種源對體胚誘導的影響

將8月下旬在沈陽農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)、遼寧省實驗林場(撫順清原灣甸子鎮(zhèn))地車溝工區(qū)采集未成熟蒙古櫟種子，分別標記為種源1、種源2，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同上。

每種處理接種30個外植體，重復3次。觀察愈傷組織形態(tài)并統(tǒng)計胚性愈傷組織的誘導率。

1.2.2 繼代培養(yǎng)

初代培養(yǎng)30 d后，選擇生長旺盛、顏色為乳黃色或乳白色的胚性愈傷組織，進行繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配比篩選。以MS為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂6 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、水解酪蛋白0.5 g·L-1，添加NAA (0.1、0.5、1 mg·L-1)和6-BA(0、0.5、1、2 mg·L-1)。每種處理接種30個外植體，重復3次。30 d后觀察胚性愈傷組織增殖情況。

愈傷組織誘導率=(誘導出愈傷組織的外植體數(shù)量/接種的外植體總數(shù))×100%

體胚誘導率=(誘導出體胚的外植體數(shù)量/接種的外植體總數(shù))×100%

1.2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度(23±2)℃，光照強度2 000～3 000 lx，光照時間16 h·d-1，培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel對所獲得數(shù)據(jù)進行記錄、統(tǒng)計，使用SPSS Statistics 17.0對數(shù)據(jù)進行處理，采用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時間對初代培養(yǎng)的影響

不同取材時間對胚性愈傷組織的誘導存在顯著影響(表1)?？傮w來看，以7月上旬采集的種子(合子胚大小約10 mm)為外植體，體胚誘導率最高85.7%。7月下旬到9月上旬外植體的體胚誘導率逐漸下降，8月開始產(chǎn)生愈傷組織的時間較長。因此，在體胚誘導過程中外植體應(yīng)選取7月上旬蒙古櫟未成熟合子胚。

表1 取材時期對體胚誘導的影響

2.2 不同激素配比對初代培養(yǎng)的影響

由表2可知，不同質(zhì)量濃度激素配比對體胚誘導差異顯著。當只添加2,4-D時，體胚誘導率很低。隨著6-BA質(zhì)量濃度增加，體胚誘導率顯著提高，但當6-BA質(zhì)量濃度超過1 mg·L-1時，體胚誘導率開始下降；當2,4-D質(zhì)量濃度逐漸增加時，體胚誘導率隨之上升。由此可知，添加2,4-D和6-BA可顯著提高體胚誘導率。因此蒙古櫟未成熟合子胚的最佳誘導培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+水解酪蛋白0.5 g·L-1，誘導率77.7%。

表2 不同激素配比對體胚誘導的影響

2.3 光照條件對初代培養(yǎng)的影響

由圖1可知，蒙古櫟未成熟合子胚誘導出的愈傷組織有兩種狀態(tài)：光照培養(yǎng)下(圖1a、b)呈白色團狀，表面滑膩，結(jié)構(gòu)緊密，多數(shù)易形成非胚性愈傷組織；暗培養(yǎng)下(圖1c)愈傷組織生長健壯，呈白色顆粒狀，可多次繼代增殖培養(yǎng)。

由表3可知，光照培養(yǎng)的體胚誘導率最高76.7%，暗培養(yǎng)的體胚誘導率最高77.7%，兩者差異不顯著。因此為獲取胚性愈傷組織，應(yīng)選用暗培養(yǎng)。

2.4 種源對初代培養(yǎng)的影響

不同種源均能誘導出胚性愈傷組織，但誘導率差異顯著(表4)。在激素配比為2,4-D 0.5 mg·L-1、6-BA 1 mg·L-1的條件下，種源2的誘導率最高49%，且高于種源1；其余3種處理下，種源1的誘導率均高于種源2，且2,4-D 1 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1的誘導率最高56.7%。由圖2可知，種源對愈傷組織的狀態(tài)也存在影響，種源2的未成熟合子胚(去子葉)在培養(yǎng)過程中容易褐化(圖2 a)，繼續(xù)培養(yǎng)容易變成結(jié)構(gòu)緊密的非胚性愈傷組織(圖2 b)。

注：a光照培養(yǎng)條件下愈傷組織結(jié)構(gòu)緊實；b光照培養(yǎng)條件下愈傷組織表面滑膩；c黑暗培養(yǎng)條件下愈傷組織顏色為白色，呈現(xiàn)出顆粒狀，結(jié)構(gòu)松散。

表4 不同種源對體胚誘導的影響

注：a種源2未成熟合子胚誘導的愈傷組織；b經(jīng)過繼代的種源2的未成熟合子胚誘導的愈傷組織。

2.5 不同激素配比對繼代培養(yǎng)的影響

從表5可以看出，在NAA 0.5 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1的激素配比下，培養(yǎng)14 d即可在白色顆粒狀愈傷組織(圖3 a)和褐色顆粒狀愈傷組織(圖3 b)的表面觀察到白色透明、大小不一的球形胚(圖3 c、d)，培養(yǎng)至第4周左右球形胚繼續(xù)生長發(fā)育變大、變多(圖3 e、f)，且體胚增殖率最大72.3%。當激素質(zhì)量濃度過高時，在繼代培養(yǎng)過程中容易變?yōu)榘咨蚝稚o實結(jié)構(gòu)(圖3 i)的非胚性愈傷組織，在培養(yǎng)過程中不能繼續(xù)分化出球形胚(圖3 h)。

表5 NAA、6-BA對體胚增殖率的影響

3 結(jié)論與討論

7月上旬是蒙古櫟未成熟合子胚初代培養(yǎng)的最佳取材時期。最佳初代培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+水解酪蛋白0.5 g·L-1，誘導率85.7%。取材時間對胚性愈傷組織的誘導有顯著差異；光照條件對胚性愈傷組織的誘導差異不顯著，但暗培養(yǎng)下生長健壯，可多次培養(yǎng)。不同種源對胚性愈傷組織的誘導率有顯著差異。最佳繼代培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+水解酪蛋白0.5 g·L-1，增殖率72.3%，且培養(yǎng)4周是最佳培養(yǎng)時間。

注：a白色顆粒愈傷組織上誘導出的球形胚；b褐色愈傷組織上誘導出的球形胚；c繼續(xù)培養(yǎng)白色顆粒愈傷組織上大小不同的球形胚；d繼續(xù)培養(yǎng)褐色愈傷組織上大小不同的球形胚；e球形胚聚集現(xiàn)象；f培養(yǎng)4周左右白色顆粒愈傷組織上誘導出的球形胚；g培養(yǎng)6周左右球形胚停止生長發(fā)育；h高濃度激素培養(yǎng)下產(chǎn)生的非胚性愈傷組織；i褐色團狀非胚性愈傷組織。

影響蒙古櫟體胚誘導的原因諸多，如外植體、外源激素類型及配比、基因型以及培養(yǎng)環(huán)境等。本文主要研究了種源、未成熟合子胚取材時間、外源激素配比和光照條件對胚性愈傷組織誘導的影響。植物激素是體胚誘導過程中關(guān)鍵的因素，由于2,4-D是體胚發(fā)生過程中的重要激素，可單獨使用也可配合細胞分裂素使用，所以大多數(shù)植株在誘導胚性愈傷組織時會選用2,4-D[13]。張濤[14]在研究蕓芥Erucasativa體細胞胚胎發(fā)生時發(fā)現(xiàn)，添加2,4-D的培養(yǎng)基誘導蕓芥胚性愈傷組織的效果最佳，且2,4-D質(zhì)量濃度過高或過低都不利于體胚發(fā)生或增殖。6-BA屬于細胞分裂素，誘導速度快，誘導率高，單獨使用時多以直接體胚發(fā)生為主。張存旭[15]在栓皮櫟體胚誘導研究中同時加入NAA和6-BA兩種激素，愈傷組織質(zhì)地較好且多為胚性組織。本研究選擇2,4-D和6-BA配合使用，以間接體胚發(fā)生，能顯著提高胚性愈傷組織誘導率。成功誘導胚性愈傷組織后繼代增殖，用NAA[16]代替2,4-D，并適當降低質(zhì)量濃度，成功誘導出球形胚，這與魏爽[10]在遼東櫟體胚增殖階段的結(jié)果一致。但后續(xù)隨著繼代增殖次數(shù)增多，胚性愈傷組織的胚性能力下降，這與阿拉伯橡膠樹[17]體胚發(fā)生過程得出的結(jié)論非常相似。在今后的實驗研究中，應(yīng)重點探究如何保持愈傷組織胚性并及時剔除非胚性愈傷組織，在愈傷組織胚性活力較強時轉(zhuǎn)入合適的體胚誘導培養(yǎng)基中[18]。

一般來說，分化程度低的組織更利于體胚誘導。研究表明，合子胚是誘導植物體胚發(fā)生最理想的材料，合子胚的取材時間對體胚誘導存在一定的影響。楊玲等[19]在研究花曲柳體胚誘導中發(fā)現(xiàn)，未成熟合子胚的體胚誘導率明顯高于成熟合子胚。本研究表明，取材時期不但會影響誘導率，還會影響愈傷組織的質(zhì)地。從實驗數(shù)據(jù)來看，7月上旬的體胚誘導率最高，該時期的外植體為未成熟合子胚，8月至9月上旬合子胚逐漸成熟，體胚誘導時間變長且誘導率逐漸下降，這與姚增玉[20]在栓皮櫟體細胞胚胎發(fā)生研究的結(jié)果一致。此外本研究發(fā)現(xiàn)種源對體胚誘導影響差異顯著，可見基因型對體胚誘導的重要性。

光照條件對于體胚發(fā)生也有顯著影響，且不同植株對于光的敏感性也不同。有些植株在體胚誘導過程中需要光照，如青岡櫟Cyclobalanopsisglauca在體胚誘導時，只能在光下進行，移至黑暗處則不再形成體胚[21]。而北美鵝掌楸Liriodendrontulipifera胚狀體在黑暗條件下發(fā)育健壯，在光下多形成畸形胚，且生長緩慢[22]。本研究中光照條件對體胚誘導率影響不顯著，但是在暗培養(yǎng)下愈傷組織生長更健壯，能長時間保持新鮮，而光下培養(yǎng)的愈傷組織容易發(fā)生褐化，多次繼代后易形成非胚性愈傷組織。但本研究在繼代增殖過程中只誘導出球形胚，對于繼代增殖的研究還有待于進一步完善。