朱海佳 崔群香 成紅林 趙妍 何蕓 邵英 錢麗君 柏文軍

摘 要 以茄子花藥培養(yǎng)再生的單倍體植株D5為實驗材料，采用壓片法和冷凍切片法對其花粉母細胞的減數(shù)分裂過程及雄配子體的形態(tài)和活力等進行觀察，綜合比較分析不同發(fā)育時期的細胞學及形態(tài)特征，并用D4、D8和D23單倍體植株對減數(shù)分裂及其結束的特征進行了驗證。結果表明：D5體細胞染色體數(shù)目為12，證實其為單倍體植株;茄子單倍體花粉母細胞的胞質(zhì)分裂方式屬于同時型，四分體以正四面體型或十字交叉型為主;分裂末期常形成大小不一的小孢子，綜合證實單倍體高度不育的特點。D5單倍體植株花粉活力僅15%，且有活力的花粉形狀不整齊;其果實褐變速度快且結實率低。單倍體植株花粉母細胞減數(shù)分裂過程與花蕾大小有密切聯(lián)系，當花柄基部至合抱的花瓣前端長度較花萼筒長度短1～2 mm時，是觀察D4、D5、D8和D23茄子花粉母細胞減數(shù)分裂的最佳時期，此期的花蕾形態(tài)特征是花瓣筒端粗度明顯小于花萼片基部的花蕾粗度，花萼前端的個別裂片開始與其他裂片分離;當從花萼側面觀察到花瓣筒時，減數(shù)分裂均已經(jīng)完成。

關鍵詞 茄子;單倍體植株;花粉母細胞;形態(tài)觀察;減數(shù)分裂

茄子（Solanum melongena L.）是世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要蔬菜作物，在亞洲蔬菜生產(chǎn)中具有十分重要的地位[1]。中國茄子栽培歷史久遠，是茄子次生起源地，茄子類型和品種眾多[2]。茄子果實營養(yǎng)豐富，其中富含的維生素E、維生素P和龍葵堿等成分可以起到抗氧化等保健作用[3]。

自Guha和Maheshwari[4]在1964年通過花藥培養(yǎng)獲得首例單倍體植株以來，運用單倍體技術逐漸成為育種上的熱點[5]。在茄子上，Raina和Iyer[6]首次通過花藥培養(yǎng)途徑獲得單倍體植株。研究表明單倍體植物常常高度不育，如細胞學鑒定表明甜瓜單倍體植株的雄花和雌花均敗育[7]，西葫蘆單倍體植株也出現(xiàn)花粉敗育的現(xiàn)象[8]。單倍體具有較高的研究價值，但有性繁殖保存困難，需要加倍成二倍體后才能有效保存和研究利用。茄子單倍體植株加倍困難，盡管能夠利用扦插等方式進行繁殖，但繁殖系數(shù)很低，且對保存環(huán)境要求高，因此極大地限制了茄子單倍體的研究和利用。

研究發(fā)現(xiàn)，茄子單倍體植株間性狀差異明顯，只有部分單倍體植株能夠結實，且僅極少量植株的果實中有成熟度較高的不育種子。為了探討茄子單倍體植株難以座果和種子敗育的原因，從而有針對性地采取措施，提高花粉和卵細胞活力、種子活力，實現(xiàn)自交繁殖，有必要對單倍體植株的小孢子產(chǎn)生和雄配子體發(fā)育過程進行詳細觀察分析。

目前，關于茄子單倍體植株減數(shù)分裂、雄配子體發(fā)育過程及花粉活力的研究未見文獻報道。本研究以花藥培養(yǎng)再生的茄子二倍體植株84-1自交后產(chǎn)生的單倍體植株D5為試材，采用冷凍切片法和壓片法等對其花粉母細胞減數(shù)分裂和雄配子體發(fā)育過程進行觀察，以揭示其花粉和種子活力降低的原因，試圖為單倍體植株的有效利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為本實驗室培育保存的單倍體植株D5，該植株春夏季開花但不結實，而可在秋季低溫環(huán)境下座果。為探索總結從D5植株獲得的減數(shù)分裂結束前后的花蕾特征，選擇由花藥培養(yǎng)直接再生出的單倍體植株D4、D8和D23的花蕾，用壓片法和染色法進行觀察。

1.2 花蕾形態(tài)觀察

為了探究花蕾形態(tài)與細胞發(fā)育階段間的聯(lián)系，采集D5、D8和D23植株上不同大小的花蕾，并將其編號。用游標卡尺測定D5花蕾總長、萼筒長、花萼基部至抱合的花瓣前端長度、花萼最粗部位的直徑、合生花瓣直徑等，并通過冷凍切片法觀察其細胞發(fā)育時期，根據(jù)實驗結果總結D5植株的花蕾減數(shù)分裂前后的形態(tài)特征，并用D4、D8和D23植株上的花蕾進行驗證。驗證時選取不同形態(tài)的花蕾，用壓片法（方法見“1.5”）觀察花藥中與生殖相關的細胞發(fā)育時期，然后進行對應分析（方法見“1.5”）。

1.3 細胞發(fā)育時期鑒定

對D5各個發(fā)育時期的花藥進行冷凍切片法觀測。冷凍切片法采用新鮮的花藥，使用包埋劑將花藥覆蓋并完全冷凍后，置于切片機上切片，將切片轉移到載玻片上，用卡寶品紅染色，隨后用Nikon 80i光學顯微鏡觀察鑒定。

1.4 花粉活力的測定

取D5植株上盛開花朵的花粉，置于載玻片上，參照申書興[9]的方法，用TTC染色法測定花粉的活力。其中被染成紫紅色的花粉為有活力的花粉，無法被染色的花粉為無活力的花粉。計數(shù)5個視野里的花粉粒（總數(shù)不少于1 000粒），根據(jù)染色結果計算花粉的活力（染色花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù)×100%）。

1.5 減數(shù)分裂鑒定和染色體計數(shù)

使用壓片法對D4、D8和D23各個發(fā)育時期的花藥進行觀測，并對D5進行減數(shù)分裂鑒定和染色體計數(shù)，參照申書興[9]的方法，采用卡諾固定液固定花藥，卡寶品紅染色液染色觀察。

2 結果與分析

2.1 花蕾形態(tài)及細胞發(fā)育階段鑒定

D5花蕾測定結果見表1。觀察發(fā)現(xiàn)，4號和5號花蕾中，花粉母細胞處于減數(shù)分裂時期，6號之后的花蕾，都處于小孢子發(fā)育時期。茄子花粉母細胞減數(shù)分裂過程與花蕾大小有密切關系，當花萼基部至合抱的花瓣前端長度比其至花萼筒長度短1～2 mm時，觀察減數(shù)分裂效果較好，此時花萼裂片前端基本抱合，僅個別裂片與其他裂片分離。當多數(shù)花萼裂片開始分離時，則減數(shù)分裂結束，進入小孢子發(fā)育階段。

用D4、D8和D23驗證的結果見圖1和表2。圖1中黑色箭頭所示的D4花蕾中的母細胞處于減數(shù)分裂時期，而其余花蕾均已經(jīng)進入小孢子及隨后的發(fā)育階段;白色箭頭所示的花蕾盡管與D4上采摘的最小花蕾大小相似，但其已經(jīng)完成減數(shù)分裂，仔細觀察發(fā)現(xiàn)其花瓣筒已經(jīng)露出花萼筒，其余所有花瓣筒超出花萼筒的花蕾均已經(jīng)完成減數(shù)分裂。D8植株上采摘的1號、2號、3號、7號和8號這5個花蕾中花粉母細胞處于減數(shù)分裂時期，其余11個花蕾均完成分裂;D23植株上的1號、2號、4號和10號這4個花蕾處于減數(shù)分裂時期，其余6個花蕾中的花粉母細胞均完成分裂。形態(tài)特征與發(fā)育時期的相關性，D4、D8、D23植株與D5植株類似：花萼裂片前端基本抱合，僅個別裂片與其他裂片分離時處于減數(shù)分裂時期;當多數(shù)花萼裂片開始分離時，則減數(shù)分裂結束，進入小孢子發(fā)育階段。該指標是否適用于二倍體茄子的花蕾有待于驗證。

2.2 單倍體花藥、小孢子和花粉形態(tài)鑒定

對花藥和花粉進一步觀察發(fā)現(xiàn)，單倍體的花藥結構正常（圖2-1），但花粉母細胞由于減數(shù)分裂不正常，產(chǎn)生不正常的四分體，甚至“二分體”（圖2-2， 2-4， 2-5）。小孢子多數(shù)不能正常發(fā)育（圖2-3， 2-6），僅觀察到單核靠邊期（圖2-7）和少量二核花粉，多數(shù)小孢子解體（圖2-3），最終只有少量的花粉發(fā)育成具有3萌發(fā)溝的形態(tài)正常的成熟花粉（圖2-8）。

2.3 單倍體植株的花粉活力鑒定

花粉經(jīng)TTC染色后在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，花粉粒的大小和形狀有明顯的不同。其中有活力的花粉粒邊緣為紅色，中部為黃褐色，而非活性花粉則全部為黃褐色（見圖3， 箭頭示有活力的花粉）。通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)，有活力的花粉占15%，形狀和大小差異較大，其結出果實數(shù)量少，果實褐變速度快，果實無籽，不能產(chǎn)生后代。

2.4 單倍體植株D5減數(shù)分裂過程及染色體數(shù)目鑒定

由于冷凍切片采取的花蕾僅切到減數(shù)分裂前期、四分體和小孢子時期的花藥，因此鑒定染色體數(shù)目及對減數(shù)分裂整個過程的觀察，主要依據(jù)壓片觀察的結果。壓片結果顯示，單倍體植株D5染色體復制正常，但聯(lián)會開始即出現(xiàn)與二倍體不同的現(xiàn)象，中期Ⅰ單價體在細胞中的排列位置分散（見圖4-4），但能夠清楚地區(qū)分出12個單價體（見圖5-1， 5-2， 5-3），因此D5植株的體細胞染色體數(shù)目為12，證明該植株確實為單倍體。

由圖5可知，單倍體植株D5減數(shù)分裂過程不正常，并不一定產(chǎn)生具有4個細胞的四分體（圖5-14， 示5核花粉母細胞），可能產(chǎn)生各種類型的“四分體”（圖5-18）。

2.5 D5植株花粉敗育的原因

在觀察單倍體植株D5的減數(shù)分裂過程中發(fā)現(xiàn)：中期Ⅰ細胞中有12個單價體，證實該植株確實為單倍體植株;但中期Ⅰ的12個單價體并未排列在赤道面附近，且排列紊亂，染色體聚成2團或3團，或各自分散（見圖5-1至5-7）;根據(jù)中期Ⅱ染色體分布情況（見圖5-14， 5-15）推測，后期I以單價體分離為主（見圖5-7至5-12），存在個別單價體染色單體分離現(xiàn)象（見圖5-13）;單價體分離形式各異，以5/7分離多見，圖5-15表示5/7分離的中期Ⅱ，圖5-16和圖5-17表示后期Ⅱ，顯示后期Ⅱ存在非染色單體分離現(xiàn)象，導致四分體中染色體數(shù)目嚴重失衡，產(chǎn)生形態(tài)不正常的四分體（見圖5-18），甚至是二分體。

從減數(shù)分裂中期Ⅰ開始，D5植株的減數(shù)分裂就出現(xiàn)不正常，未發(fā)現(xiàn)正常的后期Ⅰ細胞，說明植株敗育時期在四分體形成以前，因此敗育比較徹底。推測有活力的花粉主要來源于后期I 按照12/0或11/1分離的花粉母細胞。這兩類分離方式占花粉母細胞的比例為2/7，約產(chǎn)生1/7有活力的花粉，與觀察統(tǒng)計出的花粉活力數(shù)值15%較為接近。

3 討論

單倍體是進行體細胞遺傳研究和突變育種的理想材料，花藥和小孢子培養(yǎng)技術則是獲得單倍體的重要途徑[10-11]。油菜小孢子培養(yǎng)獲得的單倍體可應用于雙單倍體育種、誘變育種和轉基因育種等研究[12]。相對于正常植株，單倍體植株僅含有半數(shù)的染色體，因此單倍體植株比正常植株在形態(tài)上較為矮小，且生育率低;同時在后代遺傳及生理生化上也表現(xiàn)出一定的差異[13-14]。

張新宇等研究表明山羊豆屬植物減數(shù)分裂過程存在一定規(guī)律，與花蕾大小和顏色密切相關[15]。草本植物關蒼術的減數(shù)分裂與花蕾大小有密切關系，在花蕾長4～12 mm時，花粉母細胞進入減數(shù)分裂時期[16]。本研究發(fā)現(xiàn)茄子花粉母細胞減數(shù)分裂過程也與花蕾大小有密切關系，當花柄基部至合抱的花瓣前端長度比花柄基部至花萼筒長度短1～2 mm時，觀察減數(shù)分裂效果較好，此期花蕾的形態(tài)特征是花萼裂片前端基本抱合，僅個別裂片與其他裂片分離，可以以此作為減數(shù)分裂觀測取材的依據(jù)，也是進行秋水仙素處理花蕾誘導染色體數(shù)目加倍的最佳時期;而當多數(shù)花萼裂片開始分離時，則減數(shù)分裂結束，進入小孢子發(fā)育階段，對于二倍體或多倍體植株，這是采摘花蕾進行花藥或小孢子培養(yǎng)的最小花蕾指標，但該指標是否適用于所有不同倍性的茄子植株，還需要進一步驗證。研究發(fā)現(xiàn)單倍體茄子植株由于減數(shù)分裂不正常，不能形成正常的小孢子，因此不適宜進行花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng)。

本研究所用的D5單倍體植株春季不結實，至秋季11月開始坐果，其花粉活力極低（15%）。切片觀察顯示單倍體茄子的胞質(zhì)分裂方式屬于同時型，后期II以單價體分離為主，也存在染色單體分離現(xiàn)象，這可能是造成該單倍體植株不育的主要原因。分裂末期常形成大小不一的小孢子，且多數(shù)小孢子處于單核靠邊期，其后發(fā)育即表現(xiàn)不正常，逐漸解體敗育，證實單倍體高度不育的特點。張彩霞等研究表明減數(shù)分裂過程中多分孢子、落后染色體等異?，F(xiàn)象會不同程度地促使小孢子中遺傳物質(zhì)不均衡，從而形成沒有育性的孢子，這是引起花粉育性低的重要原因[17]。本研究所用的D5植株春季不能結實，是否與花粉活力更低有關，需要測定全生育期花粉活力才能驗證;另外探討環(huán)境等對花粉活力的影響，并采取措施提高花粉活力，使單倍體植株能夠通過有性繁殖加倍為二倍體，是提高茄子單倍體植株保存和利用效率的新思路和新途徑，值得進一步研究。

參考文獻：

[1] 孫保娟，黎振興，李植良.茄子分子生物學研究進展[J].吉林蔬菜，2010（04）：42-46.

[2] 劉丹，崔彥玲，潛宗偉.茄子種業(yè)現(xiàn)狀及遺傳育種研究進展[J].北方園藝，2019（01）：165-170.

[3] Plazas M， Andújar I， Vilanova S， et al. Breeding for chlorogenic acid content in eggplant： interest and prospects[J]. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca， 2013， 41（01）： 26-35.

[4] Guha S， Maheshwari SC . In vitro production of embryos from anthers of datura[J]. Nature， 1964， 204（4957）： 497-497.

[5] 石江鵬，張春芬，李芙蓉，等.園藝植物小孢子培養(yǎng)技術研究進展[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2017，45（04）：669-673.

[6] Raina SK， Iyer RD. Differentiation of diploid plants from pollen callus in anther cultures of Solanum melongena L.[J]. Journal of Plant Breeding， 1973， 70（04）： 275-280.

[7] 張永兵.甜瓜細胞遺傳學、單倍體創(chuàng)制及抗蔓枯病分子標記[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2007.

[8] 蘇敏，張國裕，趙尊練，等.西葫蘆單倍體誘導及分子檢測鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2011，20（10）：79-84.

[9] 申書興.園藝植物育種學實驗指導書[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[10] 馬欣，申書興，連勇，等.茄子花藥和游離小孢子培養(yǎng)技術研究進展[J].長江蔬菜，2006（07）：39-41.

[11] 盧寶榮.花粉單倍體的遺傳品質(zhì)——花藥培養(yǎng)是否降低了育種材料的農(nóng)藝價值[J].遺傳，1993（02）：42-44.

[12] 星曉蓉.甘藍型油菜小孢子培養(yǎng)技術及其單倍體應用研究進展[J].中國種業(yè)，2011（02）：20-22.

[13] 李栒.染色體遺傳導論[M].長沙：湖南科學技術出版社，1991.

[14] 王葆生，劉湘萍，廉勇，等.單倍體育種技術研究進展[J].北方農(nóng)業(yè)學報，2018，46（05）：44-49.

[15] 張新宇，王贊，趙茂林，等.兩種山羊豆屬植物花粉形態(tài)與花粉母細胞減數(shù)分裂行為觀察[J].植物研究，2008，28（05）：540-546.

[16] 樸錦，具紅光，樸鐘云.關蒼術花粉母細胞減數(shù)分裂及其雄配子體發(fā)育研究[J].西北植物學報，2015，35（08）：1547-1553.

[17] 張彩霞，明軍，劉春，等.百合花粉母細胞減數(shù)分裂異?，F(xiàn)象觀測分析[J].生物學通報，2010，45（05）：45-47.

（責任編輯：丁志祥）