王 銳，安 婷，楊紅霞，熊汝琴

（昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昭通657000）

花椒（Zanthonxylum bungeanum Maxim）為蕓香科、花椒屬落葉灌木或小喬木[1]?；ń纷鳛槲覈鴤鹘y(tǒng)調(diào)味品，辛麻味是其主要特征風(fēng)味，也是其品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。研究人員對(duì)花椒果皮中的化學(xué)成分做了大量的研究，其化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、生物堿、麻味素、木脂素、香豆素等[2]。此外，還含有少量的甾醇類、三萜類、黃酮甙類、芳香烴類等化合物[3]?；ń纷钣刑厣某煞质瞧渎槲端兀饕且恍０奉惢衔?。該化合物大多數(shù)為鏈狀不飽和脂肪酰胺，其中以山椒素類為代表，具有強(qiáng)烈的刺激性，其它則為連有芳環(huán)的酰胺[4]。現(xiàn)代藥理研究表明，酰胺類物質(zhì)具有多種生物活性功能，如麻醉、鎮(zhèn)痛、抑菌、殺蟲、祛風(fēng)、除濕等[5]。

花椒具有喜水肥、耐瘠薄、抗旱、耐寒等特性，適合大部分地區(qū)種植[6]，在我國有著悠久的栽培歷史，種植面積廣泛。云南省是我國重要的花椒種植基地之一，昭通市則是云南省花椒產(chǎn)量的第一大主產(chǎn)區(qū)，種植有青花椒（Zanthoxylum schinifolium Zucc）和紅花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）等品種。其中青花椒種植面積超過6.67 萬公頃，約占全省的53%，主要分布于魯?shù)榭h、永善縣、彝良縣、巧家縣、大寨鄉(xiāng)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)[7]。魯?shù)榭h因其獨(dú)特的氣候條件，青花椒產(chǎn)量高，且品質(zhì)優(yōu)良，其顆粒碩大，麻味純正、濃郁，備受人們喜愛，青花椒已成為當(dāng)?shù)厝嗣竦慕?jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)。

目前，國內(nèi)外對(duì)青花椒麻味素的檢測(cè)方法沒有進(jìn)行統(tǒng)一，缺乏對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。同時(shí)，在花椒麻味等級(jí)的評(píng)判方法和評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)等方面的評(píng)價(jià)體系也不健全。人們?cè)诨ń仿槲段镔|(zhì)的成分分析和藥理作用等方面做了一定研究[8]，但在花椒麻味素含量方面的研究較少，從而導(dǎo)致花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢。筆者通過對(duì)青花椒中麻味素的提取工藝研究為魯?shù)榛ń樊a(chǎn)業(yè)的發(fā)展和花椒品質(zhì)的鑒定提供理論依據(jù)，進(jìn)而為魯?shù)榍嗷ń方⒁环N科學(xué)、合理、有效的品質(zhì)評(píng)價(jià)方法。

1 儀器及材料

1.1 儀器

RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SK5200LHC 超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；YB-150 高速多功能粉碎機(jī)（永康市速峰工貿(mào)有限公司）；DHG-9023A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；CP214電子天平（上海奧豪斯有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵（天津華鑫儀器廠）等。

1.2 材料和試劑

青花椒于當(dāng)年8月中旬采購自魯?shù)榭h梭山鄉(xiāng)。

氫氧化鈉（廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心）；鄰苯二甲酸氫鉀（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；甲醛（濟(jì)南源茂化工有限公司）等試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

麻味素是由含氮的酰胺類物質(zhì)組成，但青花椒中的蛋白質(zhì)、生物堿等物質(zhì)也有含氮成分，采用乙醇作為提取溶劑可以減少雜質(zhì)和干擾物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，故選用乙醇作為提取青花椒中麻味素的浸提溶劑[9]。在所得浸膏中滴加一定量體積分?jǐn)?shù)50%硫酸溶液，可將浸膏中麻味素的氮轉(zhuǎn)變?yōu)镹H4+,該離子能用滴定法間接測(cè)出其含量，而干擾物質(zhì)中的氮?jiǎng)t與體積分?jǐn)?shù)為50%硫酸反應(yīng)生成N3+，N3+不對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響。由于所需測(cè)定的NH4+酸性太弱，不能用NaOH 溶液直接滴定，所以選用甲醛法間接測(cè)定青花椒中麻味素的提取率[10]。其化學(xué)方程式為:

4NH4++6HCHO=（CH2）6N4H++3H++6H2O

該法使含氮成分物質(zhì)的酸性被加強(qiáng)，從而使其可采用NaOH 溶液進(jìn)行滴定[11]?；ń仿槲端睾停–H2）6N4H+反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量系數(shù)比為1，故生成的（CH2）6N4H+量與花椒麻味素的量等同。

2.1 原料預(yù)處理

將新鮮、顆粒飽滿的青花椒放于鼓風(fēng)烘箱中，在65 ℃下進(jìn)行干燥，去除籽粒后，置于粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，過60 目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 單因素試驗(yàn)制備浸膏

以乙醇為提取劑，采用超聲波輔助提取法[12-15]，考察在不同超聲時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，制備青花椒麻味素浸膏。

2.2.1 不同超聲輔助提取時(shí)間下制備浸膏

準(zhǔn)確稱取5 份5.0000 g 青花椒粉末，置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液，室溫下浸泡10 min 后，分別超聲（53kHz）浸提10、20、30、40、50 min，然后減壓抽濾，將所得濾液真空濃縮得到浸膏，冷卻至室溫進(jìn)行稱量。

2.2.2 不同料液比下制備浸膏

準(zhǔn)確稱取5 份5.0000 g 青花椒粉末，置于250 mL錐形瓶中，分別按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液，室溫下浸泡10 min 后，超聲（53kHz）浸提30 min，然后減壓抽濾，將所得濾液真空濃縮得到浸膏，冷卻至室溫進(jìn)行稱量。

2.2.3 不同乙醇濃度下制備浸膏

準(zhǔn)確稱取5.0000 g 青花椒粉末5 份，置于250 mL 錐形瓶中，分別加入100 mL 體積分?jǐn)?shù)55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液，室溫下浸泡10 min 后，超聲（53kHz）浸提30 min，然后減壓抽濾，將所得濾液真空濃縮得到浸膏，冷卻至室溫進(jìn)行稱量。

2.3 銨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化

準(zhǔn)確稱取“2.2”項(xiàng)中所得浸膏0.6000 g 置于125 mL 圓底燒瓶中，分別加入6.00 mL 一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液和4.00 mL 體積分?jǐn)?shù)50%的硫酸溶液，搖勻，溶解浸膏，待溶解完全后置于沸水浴中反應(yīng)30 min，使脂肪酸酰胺充分地轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，再加入3.00 g 活性炭，沸水浴中脫色反應(yīng)30 min，趁熱過濾，濾液冷卻加蒸餾水定容至100 mL，保存待用。

2.4 麻味素的測(cè)定

準(zhǔn)確量取“2.3”項(xiàng)溶液10.00 mL 于100 mL錐形瓶，滴加2 滴甲基紅指示劑，用0.65 mol/L，NaOH 溶液進(jìn)行滴定消除多余的酸，使溶液顏色由紅色變?yōu)辄S色。然后加入體積分?jǐn)?shù)18%甲醛溶液1.00 mL，并滴加2 滴酚酞指示劑，振蕩搖勻讓其反應(yīng)5 min，再用已知準(zhǔn)確濃度的NaOH 溶液進(jìn)行滴定，溶液終點(diǎn)顏色由黃色變?yōu)槌燃t色，記錄所消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，平行滴定3 次，求平均值，并代入以下公式，計(jì)算青花椒中麻味素的提取率。

式中，2.2696 為系統(tǒng)誤差矯正系數(shù)；C 為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L）；為3 次滴定消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均體積（mL）；14.0067 為氮的相對(duì)分子質(zhì)量；m1為花椒粉末質(zhì)量（g）；m2為浸膏總質(zhì)量（g）；m3為取用浸膏質(zhì)量（g）。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）作為研究因素，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)因素及水平，如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平Tab 1 Factors and levels of orthogonal experiment

3.結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 超聲時(shí)間

在固定料液比1∶10（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的條件下，以不同超聲時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算出不同超聲時(shí)間下各組青花椒中麻味素的提取率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)青花椒中麻味素提取率的影響Fig.1 The effect of ultrasonic time on the extraction rate of numb-taste components in Zanthoxylum schinifolium Zucc

由圖1 可知，超聲時(shí)間在10 ～30 min 時(shí)，青花椒中麻味素的提取率隨超聲時(shí)間的延長而增加；超聲30 min 時(shí)，麻味素的提取率達(dá)最大，為16.63%；之后隨著超聲時(shí)間的延長，麻味素提取率反而降低。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是由于超聲時(shí)間短，麻味素從青花椒中浸提不完全；當(dāng)超聲30 min時(shí)，青花椒中的麻味素提取充分；再繼續(xù)延長超聲時(shí)間，提取物中的雜質(zhì)增多，且浸出的麻味素也會(huì)因長時(shí)間超聲，其結(jié)構(gòu)受到破壞，從而導(dǎo)致青花椒中麻味素提取率降低，因此確定超聲30 min為宜。

3.1.2 料液比

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%、超聲30 min，以不同料液比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算出不同料液比下各組青花椒中麻味素的提取率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)青花椒中麻味素提取率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of numb-taste components in Zanthoxylum schinifolium Zucc

由圖2 可知，當(dāng)料液比為1∶10 ～1∶20（g/mL）時(shí)，麻味素的提取率逐漸升高；當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，青花椒麻味素的提取率最大，為13.43%；之后隨著料液比的增加，青花椒麻味素的提取率降低。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是料液比較小時(shí)，青花椒中麻味素溶出不充分，增大料液比促進(jìn)了青花椒中麻味素的溶出。料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，青花椒中麻味素的溶出達(dá)到飽和，再繼續(xù)增大料液比，會(huì)造成溶劑浪費(fèi)，所以確定料液比1∶20（g/mL）為宜。

3.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)

固定料液比1∶20（g/mL）、超聲30 min，以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液進(jìn)行單因素平行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算出不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液下各組青花椒中麻味素的提取率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在55%～75%時(shí)，青花椒中麻味素的提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大至75%時(shí)，麻味素提取率最高，為17.72%；之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，青花椒中麻味素的提取率逐漸降低。這是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)較小時(shí)，溶液極性較大，不利于青花椒中麻味素的提取；而乙醇體積分?jǐn)?shù)較大時(shí)，溶液極性降低，青花椒中一些脂溶性成分溶出，抑制麻味素的提取，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大至95%時(shí)，麻味素的提取率急劇降低為8.21%。根據(jù)“相似相溶”原理，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)75%為宜。

3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)“2.5”實(shí)驗(yàn)按L9（33）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab 2 Results and analysis of orthogonal experiment

分析表2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得，影響青花椒中麻味素提取的主次因素順序?yàn)镃＞B＞A；青花椒中麻味素的最佳提取工藝為A2B1C1，即料液比1∶20（g/mL）、超聲20 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，青花椒中麻味素的提取率最高。

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取5 份5.0000 g 青花椒粉末，置于250 mL 錐形瓶中，按正交試驗(yàn)篩選出的最佳工藝條件進(jìn)行提取，將提取液減壓過濾，真空濃縮得到浸膏。根據(jù)“2.3”和“2.4”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算，結(jié)果如表3所示。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Verification experiment results

由表3可知，在超聲時(shí)間20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%條件下，進(jìn)行青花椒中麻味素提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，麻味素提取率分別為23.45%、23.10%、23.81%， 平均值為23.45%，RSD 值為0.29%。結(jié)果表明，由正交實(shí)驗(yàn)篩選的提取工藝條件是有效、可行的。

4 結(jié)果與討論

采用超聲波輔助提取青花椒中的麻味素，研究了超聲時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)3 個(gè)因素對(duì)青花椒中麻味素提取的影響。由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，影響青花椒中麻味素提取的主次因素順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞料液比，最佳提取工藝為超聲20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，青花椒中麻味素的提取率最高，為23.45%。

青花椒中的麻味素有著較高的藥用價(jià)值，其檢測(cè)方法較多，如高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法等，這些儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，所需實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較高，且缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，不易推廣。采用超聲波輔助提取，甲醛滴定法測(cè)定花椒中的麻味素，其操作簡捷、高效，所需儀器、試劑成本低，在實(shí)際應(yīng)用中更便于推廣。本研究結(jié)果為昭通魯?shù)榭h花椒的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。