黃先敏，孫建美，范 莉，張可滿

（昭通學院 農(nóng)學與生命科學學院，云南 昭通 657000）

天麻（Gastrodia elata.Bl.）屬于蘭科異養(yǎng)植物[1]。無根、葉，通過消化吸收蜜環(huán)菌的菌絲獲取營養(yǎng)。傳統(tǒng)上天麻常作為藥用[2]，用于中醫(yī)治療疾病已有2000 多年的歷史[3]。天麻中含有天麻素、天麻多糖、天麻苷元[4]、蛋白質(zhì)及氨基酸等有效成分[5-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，天麻具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥[7]、提高免疫力及改善記憶力等多種作用，并且對治療各種暈眩有顯著的療效[8]。在心血管方面，有降低血壓、抗凝血、抗血小板聚集及腦缺血保護作用[9-12]。天麻產(chǎn)量的增加和作為藥食兩用物質(zhì)的確定[13]，為開發(fā)天麻的其它用途提供了保障。天麻在人體及其它動物上研究運用較多，在微生物上的研究報道較少，能否影響微生物代謝情況的報道還未曾有過。

乳酸菌（Lactic acid bacteria）是一類能發(fā)酵碳水化合物，產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱。保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是乳酸菌類的益生菌[14]。保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌間有互惠共生作用，二者混合作為發(fā)酵乳制品的重要發(fā)酵劑菌種而被廣泛應用[15]。乳酸菌具有調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡，促進食物消化，維持微生態(tài)平衡，提升機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[16]，增強機體免疫力及延緩人體衰老等功能[17]；同時具有抑制腫瘤[18]，降低血清中的膽固醇含量，調(diào)節(jié)血壓等重要的生理活性[19]。

本實驗在乳酸菌的培養(yǎng)基中加入天麻提取液，以添加純凈水為對照，通過肉眼對乳酸菌在兩種培養(yǎng)基中的發(fā)酵過程觀察，制作臨時裝片進行顯微觀察，收集不同發(fā)酵時間段內(nèi)的發(fā)酵液，測定其中的氨基酸含量，通過含量間的差異性比較，以此來確定天麻提取液對乳酸菌發(fā)酵過程中氨基酸代謝的影響，為天麻在其它領(lǐng)域和行業(yè)的開發(fā)應用提供一些思路和方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料的來源

乳酸菌菌種：嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合菌種（來源于來思爾裸酸奶，云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司生產(chǎn)）；天麻（昭通市神農(nóng)烏天麻良種繁育有限公司提供）；純牛奶（昆明雪蘭牛奶有限責任公司）；乳蔗糖（云南楚雄祿豐縣平浪鎮(zhèn)舍資街）。

1.2 實驗方法

本論文以在乳酸菌培養(yǎng)基中加入純凈水為對照（CK），對添加天麻提取液的乳酸菌培養(yǎng)基中的氨基酸含量進行測定分析，氨基酸含量采用茚三酮顯色測定法，實驗設置樣品重復6 次，在570 nm 的波長下進行測定，對測定的結(jié)果進行方差分析。

1.2.1 天麻提取液的制備

準確稱取20 g 天麻粉（過80 目篩），加入200 mL 純凈水，用FA25 高剪切分散乳化機攪拌均勻，轉(zhuǎn)速10000 r/min，時間10 min，將混合液倒入離心管內(nèi)，在AK/GL-20B 型高速冷凍離心機內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速8800 r/min，時間10 min，上清液為天麻提取液，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基的制作

添加天麻提取液的培養(yǎng)基配方：加入純牛奶500 g、白砂糖67 g、天麻提取液132 g 混合均勻。CK 的配方：加入純牛奶500 g、白砂糖67 g、純凈水132 g 混合均勻。在這兩種培養(yǎng)基中分別加入來思爾裸酸奶100 g，利用其中的乳酸菌（嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）進行發(fā)酵。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵的過程觀察

將上述兩種的培養(yǎng)基放在溫度為40 ℃，相對濕度50%，在光照下，進行發(fā)酵培養(yǎng)，然后每隔20 min 觀察一次培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)基的組織形態(tài)及質(zhì)構(gòu)變化，收集0、80、140、160、200、240、360、420、500、600、740 min 時間段的發(fā)酵液作為實驗材料。

1.2.4 樣品溶液的制備

取1.2.4 所收集不同時間段的發(fā)酵液5 mL，放入錐形瓶中，再加入10 mL 娃哈哈純凈水，放在恒溫水浴鍋中，沸水浴30 min，取出后室溫冷卻，定容到25 mL 的容量瓶中，將定容后的溶液進行抽濾，取濾液備用。

1.2.5 樣品溶液的測定

取樣品溶液0.2 mL，加入2%的茚三酮溶液0.4 mL 和pH5.6[20]的磷酸緩沖液溶液0.2 mL,充分搖勻，沸水浴15 min，取出后，立即放入裝有自來水的燒杯中，冷卻至室溫，再加入4.8 mL 純凈水。然后以純凈水為空白對照，用紫外-分光光度計在570 nm 的波長下測定其吸光度。

1.2.6 氨基酸標準曲線的繪制

標準溶液的配制：稱取0.1 g 谷氨酸加純凈水溶解，定容到100 mL 容量瓶中，配成1 mg/mL的母液。再從中取0、1、2、4、8、10 mL 母液于25 mL 的燒杯中，分別加入20、19、18、16、12、10 mL 純凈水配成0、50、100、200、400、500 μg/mL 的標準溶液。

標準曲線的制作：分別取2.7.1 所述標準溶液0.2 mL，加2%的茚三酮溶液0.4 mL，pH5.6 的磷酸緩沖液0.2 mL，沸水浴15 min 取出后，放入裝有自來水的燒杯中，冷卻至室溫后，加入4.8 mL純凈水。溶液中的質(zhì)量濃度為0、2、4、8、16、20 μg/mL，在波長為570 nm下,測定溶液的吸光度。以吸光度為橫坐標，質(zhì)量濃度為縱坐標，得氨基酸的標準曲線，如下圖。

從圖1 中可見，吸光度與質(zhì)量濃度間的線性關(guān)系式為y=17.827x+0.0676（R2=0.9968），表明在0～20 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 氨基酸的標準曲線圖

1.2.7 儀器的精密度、準確性及重復性實驗

取未發(fā)酵的CK 培養(yǎng)基，參照1.2.5 和1.2.6 的步驟進行處理，測其吸光度，重復6 次，計算其RSD 值為2.972%，可知儀器的精密度高，實驗的準確性和重復性好。

2 結(jié)果

2.1 兩種乳酸菌培養(yǎng)液的顯微結(jié)構(gòu)

圖2 CK 中乳酸菌的顯微圖圖（放大倍數(shù)400 倍）

從圖中可以看出，添加天麻提取液的發(fā)酵液中，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的細胞相對于未添加天麻提取液中的細胞大。兩者嗜熱鏈球菌呈分散的顆粒狀，保加利亞乳桿菌呈短桿狀。

用添加天麻提取液的發(fā)酵液和添加純凈水的發(fā)酵液制作裝片，在顯微鏡下，觀察其發(fā)酵液中乳酸菌的顯微結(jié)構(gòu)，如下圖。

圖3 添加天麻提取液乳酸菌的顯微圖

2.2 不同發(fā)酵時間段培養(yǎng)液的組織型態(tài)結(jié)構(gòu)情況

將制作好的培養(yǎng)基放在溫度為40 ℃，相對濕度50%，光照下進行發(fā)酵培養(yǎng)。每隔20 min 觀察一次培養(yǎng)基，將有明顯組織型態(tài)結(jié)構(gòu)變化的發(fā)酵液記錄下來，結(jié)果見表1。

表1 不同時間段發(fā)酵液的情況

從表1 中可以看出，添加天麻的發(fā)酵液在0 ～160 min 時呈乳白色的液體狀，隨著發(fā)酵時間的延長，到200 min 時發(fā)酵液開始出現(xiàn)粘稠感，240 min 時粘稠感增強，邊緣開始出現(xiàn)凝固狀態(tài)，420 min時呈半凝固狀態(tài)，500 min時液體完全凝固，直至到600 min 時開始出現(xiàn)分層現(xiàn)象，700 min 分層現(xiàn)象比較明顯。CK 發(fā)酵液在0 ～200 min 時呈乳白色的液體狀態(tài)，240 min 開始有粘稠感，隨著時間的延長，360 min 時粘稠感逐漸增強，邊緣開始凝固，有膠質(zhì)感，420 min 開始呈半凝固狀態(tài)，500 min 時呈半凝固狀態(tài)，600 min 液體完全凝固，700 min 開始出現(xiàn)分層現(xiàn)象。

2.3 不同發(fā)酵時間段的氨基酸的含量

將添加天麻的乳酸菌發(fā)酵液和未添加天麻的乳酸菌發(fā)酵液在570 nm 的波長下，測其吸光度，經(jīng)計算可得不同發(fā)酵時間段發(fā)酵液中氨基酸的含量（mg/L），結(jié)果見表2。

表2 不同發(fā)酵時間段中氨基酸含量（mg/L）

從表2 中可以看出，添加天麻提取液的起始氨基酸含量為1146.04 mg/L，CK 為609.80 mg/L，添加天麻提取液的起始氨基酸含量高于CK 含量536.24 mg/L，是因為天麻中含有氨基酸的量為29.090 mg/g[21]，所以在發(fā)酵起始階段，添加天麻提取液中的氨基酸含量高于對照中的含量。隨著發(fā)酵時間的進行，添加天麻的乳酸菌在360 min 時，氨基酸含量為556.63 mg/L 是為最低點，CK 在240 min時到達含量的最低點，為264.03 mg/L，可見，添加天麻能延長乳酸菌對氨基酸的利用時間。到達最低點后，隨發(fā)酵時間的延長，氨基酸的含量不斷增加，在740 min 時含量到達最高點。

為了更加直觀清晰地表達出兩種發(fā)酵液中氨基酸的含量變化情況，以時間為橫坐標，不同發(fā)酵時間段的氨基酸含量為縱坐標，做成氨基酸含量的變化曲線圖，見圖4。從圖4 中可以看出，添加天麻提取液中的氨基酸含量在0 ～360 min 時，呈下降趨勢，CK 中氨基酸的含量在0 ～240 min呈下降的趨勢，說明天麻對乳酸菌中氨基酸的利用有促進作用。添加天麻提取液中氨基酸含量在360 ～740 min 呈上升的趨勢；CK 在240 ～740 min呈緩慢上升的趨勢；同時添加天麻提取液中氨基酸的合成量遠大于CK 中的合成量，表明天麻有促進乳酸菌代謝合成氨基酸的作用。另外，實驗觀測在40 ℃下，發(fā)酵740 min 以后，培養(yǎng)基中氨基酸的含量處于一個相對穩(wěn)定的狀況。

圖4 不同發(fā)酵時間段中氨基酸的含量變化圖

2.4 乳酸菌對培養(yǎng)液中氨基酸的利用量

2.4.1 氨基酸的降解量

以初始氨基酸的含量減去在最低點的氨基酸含量來表示乳酸菌對氨基酸的降解量，可知添加天麻的培養(yǎng)液對乳酸菌降解氨基酸的情況見表3。

表3 氨基酸降解量（mg/L）

從表3 中可以看出，添加天麻提取液的乳酸菌培養(yǎng)液中氨基酸的降解量為589.31 mg/L，對照組乳酸菌培養(yǎng)液中的氨基酸降解量為346.19 mg/L，可見在有天麻提取液的培養(yǎng)基中，乳酸菌對氨基酸的降解量高于對照243.12 mg/L，可見在乳酸菌發(fā)酵前期，天麻有促進乳酸菌降解氨基酸的作用。

2.4.2 降解量的方差分析

為了進一步分析添加天麻提取液和未添加天麻提取液中氨基酸降解量的差異顯著性，采用SPSS軟件對乳酸菌氨基酸的降解量進行方差分析，分析結(jié)果如表4所示。

表4 氨基酸降解量的方差分析

由表4 數(shù)據(jù)可知，經(jīng)方差分析與顯著性檢驗的F=173.778，查F 臨界值表[22]，當a=0.05，df1=1，df2=10 時，F(xiàn)0.05（1,10）=4.96，F(xiàn)0.01（1,10）=10.04，則F＞F0.01。說明添加天麻，乳酸菌的氨基酸降解量與CK 具有極差異顯著性。

2.5 乳酸菌合成氨基酸的量

2.5.1 氨基酸合成的量

在發(fā)酵液中，乳酸菌對氨基酸的降解量到達最低點后，隨著乳酸菌的進一步生長代謝，乳酸菌開始合成氨基酸，氨基酸的含量在不斷地增加，到達一定的時間后，氨基酸的含量不再變化，以從低點開始，氨基酸含量增大到不再變化時的氨基酸含量減去低點氨基酸的含量，即為乳酸菌合成氨基酸的量，結(jié)果見表5。

表5 氨基酸合成量

從表5 中可以看出，添加天麻的乳酸菌對氨基酸合成量的增加為407.33 mg/L，CK 的乳酸菌氨基酸合成量的增加為281.15 mg/L，可見在有天麻提取液的培養(yǎng)基中，乳酸菌對氨基酸的合成量高出對照126.18 mg/L，說明天麻有促進乳酸菌合成氨基酸的作用。

2.5.2 氨基酸合成量的比較分析

為進一步分析添加天麻提取液和未添加天麻提取液中氨基酸合成量的差異性，采用SPSS 軟件對氨基酸合成量進行方差分析，結(jié)果如表6。

表6 氨基酸合成量方差分析

由表6 數(shù)據(jù)可知，經(jīng)方差分析與顯著性檢驗的F=84.67，查F 臨界值表[22]，當a=0.05，df1=1，df2=10 時，F(xiàn)0.05（1,10）=4.96，F(xiàn)0.01（1,10）=10.04，則F＞F0.01。說明添加天麻，乳酸菌對氨基酸的合成量與CK 間具有極差異顯著性。

3 討論

牛乳中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，但游離氨基酸的含量很低，為滿足細胞（嗜熱鏈球菌）生長的基本需求，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌協(xié)同共生，共同滿足2 種菌株生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的需求。嗜熱鏈球菌為保加利亞乳桿菌提供甲酸、葉酸、丙酮酸和CO2，保加利亞乳桿菌產(chǎn)生的多肽類和氨基酸可以刺激嗜熱鏈球菌的生長，提供二者所需的大部分氨基酸，但卻不能完全滿足含硫氨基酸和支鏈氨基酸生物合成的要求[15]。嗜熱鏈球菌是營養(yǎng)缺陷型菌株，精氨酸和丙氨酸是嗜熱鏈球菌生長的必需氨基酸。絲氨酸、組氨酸、亮氨酸、纈氨酸和色氨酸對嗜熱鏈球菌的生長起著重耍作用，缺乏造成生長速率降低，產(chǎn)酸減少。賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和蘇氨酸對嗜熱鏈球菌的生長起著比較重要的作用，缺乏會使其生長變緩，產(chǎn)酸降低，對嗜熱鏈球菌的生長作用重要性稍弱于前面所述的氨基酸[23]。天麻水提物中精氨酸的含量為0.88 mg/g，丙氨酸為1.85 mg/g，絲氨酸1.31 mg/g，組氨酸0.68 mg/g，亮氨酸0.59 mg/g，纈氨酸0.86 mg/g，賴氨酸0.66 mg/g，苯丙氨酸0.59 mg/g，酪氨酸0.23 mg/g 和蘇氨酸0.69 mg/g[21]?？梢娫谂囵B(yǎng)液中加入天麻提取液，可以滿足嗜熱鏈球菌對氨基酸的需求。

本實驗采用茚三酮比色法測定乳酸菌發(fā)酵液中的氨基酸含量。添加天麻提取液的起始氨基酸含量為1 146.04 mg/L，CK 為609.80 mg/L，這是因為天麻中氨基酸的含量為2.730～2.927%[24]。添加天麻的乳酸菌在發(fā)酵到360 min 時，為最低點，含量為556.63 mg/L，CK 在240 min 時到達最低點，含量為264.03 mg/L；添加天麻對乳酸菌發(fā)酵液中氨基酸的降解量為589.31 mg/L，CK 的降解量為346.19 mg/L，高出CK 組243.12 mg/L，可見前期天麻有促進乳酸菌對氨基酸降解的作用。在后期（360 ～740 min），氨基酸的合成量在不斷增加，直到740 min 之后，無顯著增加，添加天麻的乳酸菌氨基酸合成量遠遠大于CK 氨基酸的合成量，高出CK 合成量126.18 mg/L，可見在后期天麻有促進氨基酸合成的作用。據(jù)葉紅[25]等人研究報道可知，天麻中氨基酸種類含量較為豐富，主要有天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、脯氨酸等多種氨基酸；這些氨基酸（除脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮發(fā)生反應，生成藍紫色的化合物，所以選擇570 nm 的波長測其吸光度。同時，這些氨基酸與茚三酮發(fā)生反應是在弱酸性條件下，茚三酮是一種強氧化劑，在弱酸性環(huán)境中與α-氨基酸共熱，引起氧化脫氨反應，形成的產(chǎn)物還原型茚三酮能與另一個茚三酮分子和NH3縮合生成藍紫色的化合物[26]。本實驗配制pH5.6 的磷酸緩沖溶液，提供弱酸反應環(huán)境，使氨基酸能與茚三酮完全充分地進行顯色反應，保證實驗結(jié)果的準確性。據(jù)丁明潔[27]的儀器分析可知，吸光度在0.2 ～0.8 范圍時，儀器的相對誤差較小，調(diào)整待測溶液濃度，使其吸光度控制在0.2 ～0.8 的范圍內(nèi)，確保儀器測量的精密度和準確度。通過實驗獲知，天麻在前期有促進氨基酸降解的作用，后期有促進氨基酸合成的作用。但究竟是天麻中的單一物質(zhì)起作用，還是多種物質(zhì)共同起作用，這都將有待于進一步地實驗探討。