趙建波，劉 峰，孫 亮

0 引言

慢性腦缺血缺氧能引起腦細胞損傷，甚至腦部病變，如腦組織水腫、軟化及壞死等[1]。而許多疾病，如腦梗死、頸部血管斑塊或堵塞、腦血管硬化等均可導致腦部缺氧，進而損傷神經(jīng)細胞，加重病情[2-3]。因此，如何防治慢性腦部缺氧具有重要意義。尼莫地平(Nimodipine，NP)作為脂溶性的雙氫吡啶類鈣離子拮抗藥，易通過血腦屏障并與中樞神經(jīng)的特異受體結合，起到擴張腦血管和增加腦血流量的作用[4]。在臨床上，NP已被應用于保護缺血性神經(jīng)元、改善腦循環(huán)及治療血管性癡呆等[5]。LINK-A是長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)的家族成員之一，分子量約為1.5 kb，亞細胞定位于細胞質(zhì)[6]。研究顯示，lncRNA LINK-A與多種腫瘤細胞惡性進展有關[7]。還有研究顯示，lncRNA LINK-A可能通過激活HIF1α信號通路改善糖尿病性腎病的治療[8]。但lncRNA LINK-A是否參與NP對缺氧誘導的神經(jīng)細胞的保護還未見報道。本研究以SK-N-SH細胞作為研究對象，通過三氣培養(yǎng)箱構建缺氧環(huán)境，觀察NP對缺氧神經(jīng)細胞的保護作用，并探討lncRNA LINK-A在其中的作用，為臨床治療慢性腦缺氧提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞購自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 NP(貨號N149，純度≥98%)購自美國Sigma-Aldrich公司，以DMSO配制母液；TUNEL染色試劑盒、噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物公司；MEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司；lncRNA LINK-A過表達慢病毒轉染試劑盒購自上海吉瑪公司；反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；Bcl-2抗體、p-AKT抗體、AKT抗體及GAPDH抗體購自美國CST公司；抗兔IgG、HRP二抗購自上海愛必信公司。

1.1.3 主要儀器 電子天平，美國賽多利斯公司產(chǎn)品；SpectraMax 190酶標儀，美國Molecular Devices公司產(chǎn)品；Centrifuge 5424 R高速冷凍離心機，德國eppendorf公司產(chǎn)品；Mx3000/Mx3005P 實時熒光定量PCR儀器，美國安捷倫公司產(chǎn)品；IX73倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；SQP-30/SQ三氣培養(yǎng)箱，天津瑪福爾科技有限公司產(chǎn)品；AI600凝膠成像儀，美國GE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和培養(yǎng)環(huán)境 人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞以含10%FBS和1%青-鏈霉素的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞正常培養(yǎng)環(huán)境為飽和濕度、37 ℃、95%空氣、5%CO2的培養(yǎng)箱。缺氧環(huán)境為飽和濕度、92%N2、5%CO2和3%O2的三氣培養(yǎng)箱。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率 接種細胞于兩張96孔板中，每孔8×103個細胞。次日，配制含0、5、10、20、40、80、160 μmol/L NP的MEM培養(yǎng)基，取一個96孔板，每孔按100 μl上述培養(yǎng)基加入細胞中，每個濃度設置5個復孔，同時設立調(diào)零孔，置于缺氧環(huán)境中。另一孔板每孔加入100 μl MEM培養(yǎng)基，作為對照置于正常環(huán)境中。細胞培養(yǎng)24 h時，每孔加入MTT (5 mg/ml)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。而后棄去培養(yǎng)基和MTT混合液，每孔加入二甲基亞砜100 μl。用酶標儀于490 nm處測定各孔的吸光度(OD)，計算細胞存活率。

1.2.3 慢病毒轉染法構建lncRNA LINK-A穩(wěn)定表達的SK-N-SH細胞 接種3×106個細胞于6孔板中，次日，取出帶綠色熒光標簽的空載慢病毒液和lncRNA LINK-A過表達慢病毒液，分別稀釋20倍備用。配制含10 μg/ml Polybrene的MEM全培養(yǎng)基并替換舊培養(yǎng)基，將2種慢病毒液分別加入細胞中并設為空載對照組和LINK-A過表達組，以正常SK-N-SH細胞作為空白組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，更換新的MEM全培養(yǎng)基，生長至對數(shù)期傳代于6 cm培養(yǎng)皿中，嘌呤霉素篩選細胞。熒光顯微鏡下觀察各組細胞熒光表達情況，RT-qPCR檢測lncRNA LINK-A表達水平。

1.2.4 生化儀檢測細胞LDH釋放率 接種SK-N-SH細胞于2個6孔板中，每孔3×105個細胞。次日，將一孔板置于正常環(huán)境中，作為空白組；將另一孔板分為2組，分別為缺氧組和NP組，置于缺氧環(huán)境中?？瞻捉M和缺氧組以1‰DMSO處理，NP組以NP (20 μmol/L)處理，時間為24 h。另將轉染成功的空載對照組和LINK-A過表達組，以及相應空白組細胞置于缺氧環(huán)境中24 h。按試劑盒說明書測定LDH水平，LDH釋放率(%)=上清液LDH值/(上清液LDH值+細胞內(nèi)LDH值)×100%。

1.2.5 TUNEL染色檢測細胞凋亡情況 將無菌蓋玻片置于六孔板中，每孔接種5×104個細胞。按“1.2.4”項中2種分組處理后PBS洗一遍，甲醇固定10 min，按說明書進行TUNEL染色，并以DAPI染核。熒光顯微鏡下觀察拍照并計算細胞凋亡指數(shù)。

1.2.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測lncRNA LINK-A表達 收集空白組、缺氧組和NP組細胞，采用TRIZOL法提取細胞總RNA，測定RNA濃度后，以反轉錄試劑盒將RNA轉為cDNA，cDNA稀釋備用。將lncRNA LINK-A引物稀釋，利用RT-qPCR試劑盒進行檢測，每組設置3個復孔。采用2(-△△CT)法計算lncRNA LINK-A的表達水平。空載對照組、LINK-A過表達組、相應空白組也采用上述方法檢測LINK-A表達水平。

1.2.7 蛋白印記實驗檢測p-AKT和Bcl-2蛋白表達 按“1.2.4”項中2種分組處理后，細胞以RIPA裂解液(含磷酸酶和蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，制備蛋白樣品，并以30 μg/孔蛋白進行上樣，PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜將蛋白轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育AKT(1∶2 000)、p-AKT(1∶1 000)、Bcl-2(1∶2 000)及GAPDH(1∶4 000)抗體過夜，次日洗膜后孵育抗兔IgG HRP二抗(1∶4 000)1 h，洗膜后以ECL發(fā)光液于凝膠成像儀上成像。

2 結果

2.1 NP對缺氧神經(jīng)細胞存活率、LDH釋放率及l(fā)ncRNA LINK-A表達的影響 MTT結果顯示，缺氧誘導SK-N-SH細胞存活率降低(P<0.01)。10～50 μmol/L NP均可抑制缺氧誘導的SK-N-SH細胞存活率下降(P<0.01)，其中，20 μmol/L NP的抑制效果最強，見圖1A。對照組、缺氧組及NP組LDH釋放率分別為18.6%±2.2%、69.5%±6.3%及42.9%±5.0%。與對照組比較，缺氧組LDH釋放率顯著升高(P<0.01)；與缺氧組比較，NP組LDH釋放率明顯降低(P<0.01)，見圖1B。RT-qPCR結果顯示，對照組、缺氧組和NP組lncRNA LINK-A表達分別100%、33.6%±3.0%、538.3%±43.6%。相較于對照組，缺氧組lncRNA LINK-A表達明顯降低(P<0.01)；與缺氧組相比，NP組lncRNA LINK-A表達顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖1C。

圖1 NP對缺氧神經(jīng)細胞活力、LDH釋放率及l(fā)ncRNA LINK-A表達的影響

2.2 NP抵抗缺氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡 TUNEL染法結果顯示，對照組、缺氧組和NP組細胞凋亡指數(shù)分別為12.60%±0.11%、65.50%±5.80%、40.62%±3.85%。與對照組相比，缺氧組細胞凋亡顯著增加(P<0.01)；與缺氧組比較，NP組細胞凋亡明顯降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 對照組、缺氧組和NP組細胞凋亡水平

2.3 NP逆轉缺氧誘導的p-AKT和Bcl-2蛋白表達下調(diào) 蛋白印記結果顯示，對照組、缺氧組和NP組p-AKT相對蛋白表達分別為100%、58.3%±6.5%、106.5%±8.6%，Bcl-2蛋白表達分別為45.6%±6.5%、10.2%±1.2%、96.6%±8.2%。與對照組相比，缺氧組細胞p-AKT和Bcl-2蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)；與缺氧組相比，NP組細胞p-AKT和Bcl-2蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖3。

圖3 對照組、缺氧組和NP組細胞p-AKT與Bcl-2相對蛋白表達

2.4 lncRNA LINK-A過表達抵抗缺氧誘導的神經(jīng)細胞LDH釋放率增加 熒光顯微鏡觀察顯示，空載對照組和LINK-A過表達組均顯綠色熒光，見圖4A。RT-qPCR結果顯示，相較于空載對照組，LINK-A過表達組細胞lncRNA LINK-A表達明顯升高(P<0.01)，見圖4B?？瞻讓φ战M、空載對照組和LINK-A過表達組LDH釋放率分別為73.6%±7.8%、70.5%±8.1%、32.3%±3.6%。與空載對照組相比，LINK-A過表達組LDH釋放率顯著降低(P<0.01)。見圖4C。

圖4 lncRNA LINK-A過表達對缺氧神經(jīng)細胞LDH釋放率的影響

2.5 lncRNA LINK-A過表達抵抗缺氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡 空白對照組、空載對照組和LINK-A過表達組在缺氧環(huán)境中生長24 h，TUNEL染色結果顯示，各組細胞凋亡指數(shù)分別為44.7±4.1、48.6±5.12、28.8±1.83。與空載對照組相比，LINK-A過表達組細胞凋亡顯著降低(P<0.01)，空白對照組與空載對照組差異無統(tǒng)計學意義。

2.6 lncRNA LINK-A過表達誘導p-AKT和Bcl-2蛋白表達上調(diào) 蛋白印記結果顯示，空白對照組、空載對照組和LINK-A過表達組p-AKT相對蛋白表達分別為100%、98.9%±8.9%、426.3%±40.6%，Bcl-2蛋白表達分別為82.3%±8.0%、85.5%±8.9%、356.6%±38.2%?？瞻讓φ战M和空載對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與空載對照組相比，LINK-A過表達組p-AKT和Bcl-2蛋白表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5。

圖5 空白對照組、空載對照組和LINK-A過表達組細胞凋亡情況

圖6 lncRNA LINK-A過表達對p-AKT和Bcl-2蛋白表達的影響

3 討論

腦缺氧指氧的供應或利用不能達到腦組織代謝需要的最低水平而出現(xiàn)不同程度的腦功能障礙，而慢性腦缺氧會造成不可逆轉的腦損害，甚至腦死亡[9]。許多因素可引起腦缺氧，如腦血管硬化、腦梗死、手術損傷、腫瘤、炎癥等[10]。通常情況下，慢性腦缺氧會引起線粒體功能障礙、鈣離子超載、氧化應激及炎癥反應等一系列病理變化，進而誘導神經(jīng)細胞損傷而導致細胞凋亡[11-12]。研究顯示，神經(jīng)細胞凋亡與神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥和肌肉萎縮性側索硬化癥等疾病發(fā)生發(fā)展密切相關[13-14]。因此，防治缺氧性神經(jīng)細胞損傷或凋亡對于改善或預防腦血管或腦神經(jīng)相關疾病具有重要臨床意義。

SK-N-SH細胞為人神經(jīng)母細胞瘤細胞，具有神經(jīng)細胞的特性和腫瘤細胞無限增殖的能力，廣泛應用于神經(jīng)細胞相關研究。本研究以SK-N-SH細胞作為研究對象，發(fā)現(xiàn)10～50 μmol/L NP可抵抗缺氧誘導的SK-N-SH細胞存活率降低，而且20 μmol/L NP的效果最佳，提示NP對缺氧環(huán)境中的SK-N-SH細胞具有保護作用，由于20 μmol/L NP藥效最佳，該濃度的NP被選用于后續(xù)實驗。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NP處理可抵抗缺氧誘導的SK-N-SH細胞LDH釋放率和凋亡增加。LDH存在于機體所有組織細胞胞質(zhì)內(nèi)，而缺氧損傷后細胞膜通透性改變，LDH易滲出細胞外，導致LDH釋放率增加[15]，提示NP可減輕缺氧誘導的SK-N-SH細胞損傷和凋亡。相關分子研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可誘導SK-N-SH細胞Bcl-2和p-AKT蛋白表達下調(diào)，而NP可逆轉上述蛋白表達變化。Bcl-2作為抗凋亡蛋白，在細胞凋亡中發(fā)揮抗凋亡作用[16]。研究顯示，AKT的磷酸化激活可減少細胞凋亡[17]。提示NP可能通過誘導缺氧神經(jīng)細胞p-AKT和Bcl-2蛋白表達上調(diào)抵抗細胞凋亡。

缺氧條件下，SK-N-SH細胞LINK-A表達顯著降低，而NP處理能上調(diào)LINK-A表達水平。提示LINK-A可能在NP減緩缺氧誘導的SK-N-SH細胞損傷中發(fā)揮作用。

為了進一步驗證LINK-A的生物學功能，本研究成功構建了LINK-A過表達的SK-N-SH細胞。結果發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINK-A過表達能抑制缺氧誘導的SK-N-SH細胞LDH釋放和細胞凋亡，還能上調(diào)Bcl-2和p-AKT蛋白表達。提示lncRNA LINK-A可能作為Bcl-2和p-AKT蛋白的上游調(diào)控因子，參與抵抗缺氧誘導的SK-N-SH細胞凋亡。

綜上所述，NP可能通過lncRNA LINK-A誘導p-AKT和Bcl-2蛋白表達上調(diào)，從而抵抗缺氧誘導的SK-N-SH神經(jīng)細胞凋亡。但本研究僅僅是體外缺氧模擬實驗，還有待于進一步體內(nèi)實驗進行驗證。