◎ 李永幸，李 紅，任昭瑾

（1.商丘市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河南 商丘 476000；2.新鄭市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河南 新鄭 451100）

抗菌素的大量使用不但逐步提高了細(xì)菌的耐藥性，也同時(shí)使環(huán)境受到了嚴(yán)重的污染[1]，而環(huán)境中的食源性病菌能引起食物腐敗變質(zhì)，使人們的健康受到嚴(yán)重威脅[2]。近年來，安全性高、具有抗菌性能的低聚糖獲得相關(guān)研究人員的高度關(guān)注，例如，殼低聚糖、褐藻膠低聚糖、果膠低聚糖等[3-5]。

殼低聚糖是殼聚糖降解后的產(chǎn)物，呈淺黃色或淺棕色，理化性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水[6]。殼低聚糖的聚合度為2 ～10、平均分子量5 ～30 kDa，是自然界中唯一含有正電荷的堿性氨基低聚糖，殼低聚糖的抑菌性能也多有報(bào)道[7-8]。果膠在自然中廣泛存在，其降解產(chǎn)物果膠低聚糖被認(rèn)為具有一定的抑菌功能[9]。李托平等通過山楂果膠低聚糖與其他食品添加劑的復(fù)配對(duì)食品腐敗枯草芽孢桿菌的抑菌性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明復(fù)配后比單獨(dú)使用時(shí)的抑菌效果強(qiáng)[10]。褐藻膠低聚糖由褐藻酸鈉降解獲得，是一種小分子低聚糖，與大分子褐藻酸鈉相比，其分子量低，易溶于水，具有多種生物活性，在食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域受到專家學(xué)者的高度關(guān)注[11]。其在致病菌的抑制方面也表現(xiàn)出一定的效果，YAN G L 等的試驗(yàn)表明，褐藻膠低聚糖對(duì)沙門氏菌有較強(qiáng)的抑制作用[12]。殼聚糖及殼寡糖具有良好的抗菌活性，其抗菌機(jī)制也見于報(bào)道。Mekasha 等研究表明，殼寡糖與幾丁質(zhì)相比，其結(jié)構(gòu)中的伯氨基是抗菌的主要原因[13]。黃海波等研究表明，殼寡糖具有較好的抑菌活性[14]。

本文采用不同種類的低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，并根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用正交設(shè)計(jì)的方法對(duì)不同種類的低聚糖進(jìn)行復(fù)配，以研究復(fù)配低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果，為其在新型食品抑菌劑的研究利用上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與主要試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），購自北納生物。

殼低聚糖、果膠低聚糖（純度98%）、褐藻膠低聚糖（純度99%），均購自西安百川生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯、瓊脂粉，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Hve-50 型高壓滅菌鍋，購自Hirayama 公司；LRH-250 型恒溫培養(yǎng)箱，購自鄭州生元儀器有限公司；UW220H 型電子天平，購自日本島津公司。

1.3 培養(yǎng)基制備

液體培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯18 g·L-1，分裝至250 mL三角瓶中，每瓶50 mL，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中加入15 g·L-1瓊脂粉。

1.4 菌懸液的制備

菌種先于固體培養(yǎng)基上連續(xù)復(fù)壯兩次，用接種環(huán)挑取單菌落至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌懸液，備用。

1.5 抑菌活性測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性。以1%的乙酸為溶劑，制備成不同濃度的低聚糖抑菌液，用無菌生理鹽水將菌懸液的濃度稀釋至1×108CFU·mL-1，然后取0.1 mL 菌懸液和0.1 mL 抑菌液均勻涂布在培養(yǎng)基平板上?？瞻讟訛橐?.1 mL 溶劑替代0.1 mL 抑菌液，其余與樣品相同。每組3 個(gè)平行，平板于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄各個(gè)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算抑菌率，抑菌率為樣品菌落數(shù)/空白樣菌落數(shù)×100%。

1.6 單因素試驗(yàn)

1.6.1 殼低聚糖抑菌性的單因素試驗(yàn)

調(diào)節(jié)殼低聚糖的初始濃度，依次為0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%。其他條件不變，按1.5 方法考察殼低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性能。

1.6.2 褐藻膠低聚糖抑菌性的單因素試驗(yàn)

調(diào)節(jié)褐藻膠低聚糖的初始濃度，依次為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%。其他條件不變，按1.5 方法考察褐藻膠低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性能。

1.6.3 果膠低聚糖抑菌性的單因素試驗(yàn)

調(diào)節(jié)果膠低聚糖的初始濃度，依次為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%。其他條件不變，按1.5 方法考察果膠低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性能。

1.7 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1對(duì)低聚糖進(jìn)行復(fù)配，進(jìn)行3 因素3 水平正交試驗(yàn)，水平因素見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度殼低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

由圖1 可知，隨著殼低聚糖濃度的增大，樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率逐漸增大，其中殼低聚糖濃度在0.2%～0.4%時(shí)，增速變緩，在0.4%時(shí)抑菌率達(dá)到85.5%。

2.2 不同濃度褐藻膠低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

由圖2 可知，褐藻膠低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率隨其濃度的增加而提高，濃度為0.05%～0.3%時(shí)，抑菌率增速明顯。當(dāng)濃度為0.5%時(shí)，抑菌率最大，為77.5%。

圖1 不同濃度殼低聚糖的抑菌率圖

圖2 不同濃度對(duì)褐藻膠低聚糖的抑菌率影響圖

2.3 不同濃度果膠低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

果膠來源廣泛，其分解產(chǎn)物果膠低聚糖具有一定的抑菌功能。王江浪對(duì)蘋果果膠低聚糖抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明其對(duì)這兩種細(xì)菌都有較好的抑制作用[15]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同濃度的果膠低聚糖抑制金黃色葡萄糖球菌的效果進(jìn)行研究，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同濃度果膠低聚糖的抑菌率圖

由圖3 可知，高濃度的果膠低聚糖比低濃度的抑菌效果強(qiáng)，濃度0.7%時(shí)，抑菌率達(dá)到82.4%，表明金黃色葡萄球菌對(duì)高濃度的果膠低聚糖更敏感。

2.4 低聚糖抑菌性的正交試驗(yàn)

表2 及表3 表明，3 種因素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性的主次順序?yàn)锳 ＞B ＞C，即殼低聚糖濃度對(duì)金黃色葡萄糖球菌的抑菌性影響最大，其次為褐藻膠低聚糖濃度，果膠低聚糖濃度影響最小，且殼低聚糖濃度的影響顯著，其最優(yōu)組合為A3B3C3。在正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合下進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，復(fù)配低聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為95.2%±0.6%，高于正交表中組合，表明其最佳復(fù)配濃度為：殼低聚糖0.2%，褐藻膠低聚糖0.3%，果膠低聚糖0.5%。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析表

表3 方差分析表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素及正交設(shè)計(jì)的方法對(duì)低聚糖濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳濃度，并對(duì)該濃度進(jìn)行驗(yàn)證，其最佳濃度組合為：殼低聚糖0.2%，褐藻膠低聚糖0.3%，果膠低聚糖0.5%，抑菌率達(dá)到95.2%±0.6%。