鄭宇慧，薛圣霖，趙巖巖，李勝利

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100193)

乳房炎是奶牛發(fā)病率高、流行快、危害大且造成較大經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一，患病奶牛的產(chǎn)奶量會(huì)下降約15%[1]，全球每年因奶牛乳房炎所導(dǎo)致的產(chǎn)奶量下降、廢棄奶產(chǎn)生、患病牛治療和淘汰等造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)350億美元[2]。根據(jù)患病奶牛有無明顯臨床癥狀，奶牛乳房炎可分為臨床性乳房炎和隱性乳房炎。臨床性乳房炎一般能通過肉眼可見的癥狀來確定，如乳腺發(fā)紅、發(fā)熱或腫脹，發(fā)病乳區(qū)乳汁明顯發(fā)黃或黏稠等[3]。隱性乳房炎則以乳中的體細(xì)胞數(shù)增加為特征，無明顯的臨床癥狀[4]。細(xì)菌、真菌和支原體等都能引起奶牛乳房炎，常見的乳房炎致病菌主要有葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌等[5]。隨著人類對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品需求的不斷增加，動(dòng)物生產(chǎn)中抗菌藥物的使用量預(yù)計(jì)在2010-2030年將增加67%[6]，因此，畜牧業(yè)被認(rèn)為是導(dǎo)致抗生素殘留及細(xì)菌耐藥性問題產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)[7]，其中抗生素的使用會(huì)直接影響整個(gè)食物鏈[8]。目前，對(duì)于奶牛臨床性乳房炎的治療主要依賴于抗生素，而研究發(fā)現(xiàn)抗生素雖有較好的抑菌作用，但對(duì)后期的炎癥控治無明顯效果[9]。研究表明，中草藥、益生菌和疫苗等[10-12]在替代抗生素方面潛力巨大。其中，乳酸菌具有環(huán)境友好，不易導(dǎo)致耐藥性病原菌的出現(xiàn)等優(yōu)勢，在替代抗生素防治病原微生物方面研究較多。

1 乳酸菌概述

乳酸菌是兼性厭氧性的革蘭陽性菌，可以生長于MRS和血瓊脂等培養(yǎng)基，通常為黏液樣白色菌落，在血瓊脂培養(yǎng)基上表現(xiàn)為溶血[13]。目前，乳酸菌至少可分為18個(gè)屬，200多個(gè)種，主要包括：乳桿菌屬(Lactobacilli)、肉食桿菌屬(Carnobacterii)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lacococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、片球菌屬(Pediococcus)和明串珠菌屬(Leuconostoc)等[14]。

研究表明，許多乳酸菌具有益生作用，在動(dòng)物機(jī)體的免疫和健康方面發(fā)揮著重要作用，其益生性主要體現(xiàn)在：調(diào)節(jié)腸道菌群[15]、緩減腸道疾病[16]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[17]、抗氧化[18]、抑制腫瘤[19]、降低膽固醇[20]以及延緩機(jī)體衰老[21]等。常見的益生性乳酸菌菌種主要有：嗜酸乳芽孢桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等。

2 乳導(dǎo)管注射乳酸菌防治奶牛乳房炎的作用效果

哺乳動(dòng)物的乳腺一直被認(rèn)為是無菌器官，但細(xì)菌DNA測序結(jié)果證明乳腺內(nèi)存在共生微生物群落，即“共生乳腺微生物群”[22]。這不僅對(duì)理解乳房炎的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，還為開發(fā)防治乳房炎的新型抗生素替代品提供了思路。有研究發(fā)現(xiàn)，通過向奶牛乳導(dǎo)管注射部分乳酸菌菌種，能有效預(yù)防或治療其乳房炎[23-27]。

FIONA等[23]研究發(fā)現(xiàn)，給健康荷斯坦奶牛乳導(dǎo)管注射乳酸乳球菌不會(huì)引起奶牛炎癥反應(yīng)，且奶牛乳腺中的免疫蛋白在注射乳酸乳球菌后顯著表達(dá)。KATJA等[24]研究證明，乳導(dǎo)管注射乳酸鏈球菌與抗生素治療奶牛乳房炎后，牛乳汁中的體細(xì)胞數(shù)無顯著性差異且治療后均無明顯臨床癥狀，表明乳酸菌在治療奶牛乳房炎方面具有與抗生素相似的效果。IGNACIO等[25]研究發(fā)現(xiàn)給非泌乳期荷斯坦奶牛乳導(dǎo)管注乳酸菌后，其乳汁中的lgG含量和嗜中性粒細(xì)胞的吞噬能力顯著提高，且試驗(yàn)動(dòng)物未見任何臨床癥狀。PELLEGRINO等[26]對(duì)乳導(dǎo)管注射乳酸菌預(yù)防奶牛乳房炎的效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)乳導(dǎo)管注射乳酸菌可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，從而有效預(yù)防奶牛乳房炎的發(fā)生。MICHAEL等[27]對(duì)18頭乳房炎奶牛乳導(dǎo)管注射乳酸乳球菌后發(fā)現(xiàn)，其對(duì)奶牛乳房炎的治愈率達(dá)到了47%(商業(yè)抗生素為50%)，證明其在治療奶牛乳房炎方面潛力巨大。還有研究將乳導(dǎo)管注射乳酸菌的方法進(jìn)行了創(chuàng)新，將其制成新型藥浴液進(jìn)行使用。JIE等[3]對(duì)含有2株植物乳桿菌的新型藥浴液與商業(yè)藥浴液的作用效果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)用乳酸菌制備的新型藥浴液能降低與乳房炎相關(guān)細(xì)菌的相對(duì)豐度，改善奶牛乳頭的微生物環(huán)境，可用作化學(xué)藥浴液的替代品。

盡管不少研究證明乳導(dǎo)管注射乳酸菌可以有效防治奶牛乳房炎，但也有研究對(duì)此提出質(zhì)疑，認(rèn)為乳酸菌自身亦會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，危害動(dòng)物乳房健康。MIGNACCA等[28]研究表明，乳鏈球菌雖能短暫地清除母羊乳房內(nèi)的病原菌，但也引起了中輕度的臨床性乳房炎癥狀。CARLOTTA等[29]研究發(fā)現(xiàn)，乳導(dǎo)管注射熱滅活的鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)物后牛奶中的SCC升高，且假單胞菌的相對(duì)豐度上升了4%，而此前的研究證明水牛乳房炎的發(fā)生與假單胞菌的相對(duì)豐度升高有關(guān)[30]，因此提出將其應(yīng)用于水牛乳房炎的防治仍需研究。

3 乳酸菌防治奶牛乳房炎的潛在機(jī)制

3.1 抑制致病菌的定植和黏附乳酸菌可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，如乳酸、短鏈脂肪酸、過氧化氫、一氧化氮和細(xì)菌素等，這些物質(zhì)幫助其競爭性抑制致病菌的黏附和定植，發(fā)揮益生功能[30]。其中，細(xì)菌素是細(xì)菌產(chǎn)生的具有活性的多肽物質(zhì)，能通過直接競爭性抑制病原體的入侵或調(diào)節(jié)微生物群的組成，進(jìn)而影響宿主的免疫系統(tǒng)。在腸道中，細(xì)菌素可以通過多種途徑增強(qiáng)乳酸菌的益生功能，如作為定植肽，提高其在宿主微生物群的競爭力；作為殺菌肽，直接清除病原微生物；作為信號(hào)肽，向其他細(xì)菌或者宿主免疫系統(tǒng)發(fā)出信號(hào)[31](圖1)。因此，基于乳酸菌在腸道中所發(fā)揮的益生作用，近年來有不少學(xué)者圍繞乳酸菌防治乳腺病原微生物展開研究。

圖1 細(xì)菌素促進(jìn)乳酸菌益生功能的作用機(jī)制[31]

近年來，許多研究者針對(duì)乳酸菌對(duì)多種乳房炎致病菌的抑菌能力進(jìn)行研究，得到許多具有高效抑菌能力的優(yōu)良菌株。許女等[32]研究發(fā)現(xiàn)，分離自健康牛乳導(dǎo)管中的乳酸乳球菌CM2能夠分泌黏附素黏附于人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)，從而有效抑制大腸桿菌的黏附。CAROLINA等[33]對(duì)從健康奶牛乳腺中分離得到的上百株乳酸菌的益生特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出其中9株對(duì)乳房炎致病菌如金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌等有明顯的抑制作用。WU等[34]研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖桿菌GR-1能夠有效減少大腸桿菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的黏附，減輕大腸桿菌對(duì)細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的破壞。DAMIEN等[35]以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，探究了干酪乳桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌感染的乳房炎的治療效果，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的內(nèi)化率低且存活率高，能在不改變細(xì)胞活力和形態(tài)的情況下，使金黃色葡萄球菌對(duì)細(xì)胞的內(nèi)化率降低60%～80%。

以上研究表明，部分乳酸菌菌種能有效抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等奶牛乳房炎致病菌的生長與黏附，這些具有較好抑菌效果的乳酸菌菌株的獲得，為乳酸菌防治奶牛乳房炎提供了豐富的選擇。此外，從奶牛乳腺中分離的乳酸菌可長期存活于奶牛乳房，更適應(yīng)奶牛乳房環(huán)境，并且這類乳酸菌與奶牛乳房炎致病菌長期存在競爭關(guān)系，對(duì)奶牛乳房炎致病菌的抑制作用更具有針對(duì)性，是篩選防治奶牛乳房炎的乳酸菌菌株的重要方向。

3.2 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能免疫系統(tǒng)失調(diào)是引起機(jī)體致病菌感染的重要因素，乳酸菌可以通過調(diào)節(jié)多個(gè)免疫信號(hào)通路來發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，抑制致病菌的感染。研究表明，乳酸菌能促進(jìn)機(jī)體免疫球蛋白IgA的分泌和抗菌分子的產(chǎn)生，從而抑制腸道病原菌[36]。此外，乳酸菌還能調(diào)節(jié)致病菌誘導(dǎo)的機(jī)體免疫反應(yīng)，增加抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而降低壞死性結(jié)腸炎等中的炎癥反應(yīng)[37]。近年來，乳腺中的免疫反應(yīng)一直是許多研究的重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘發(fā)的小鼠乳房炎中，Toll樣受體[38]和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)會(huì)被激活[39]，從而刺激小鼠的先天性免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。此外，當(dāng)動(dòng)物乳腺受到抗原刺激時(shí)，乳腺上皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生多種趨化因子，這些趨化因子將血液中的白細(xì)胞吸引到乳腺組織，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。IL-8的分泌受到腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor a，TNF-a)、IL-6和IL-1家族細(xì)胞因子等促炎性細(xì)胞因子的調(diào)控[40]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可參與調(diào)控上述炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而降低機(jī)體炎癥反應(yīng)。此外，部分乳酸桿菌可顯著抑制IL-8的分泌和NF-κB的激活[41]；短乳桿菌1595及1597、干酪乳桿菌1542和植物乳桿菌1610均能顯著降低由金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和乳房鏈球菌導(dǎo)致的IL-8的升高[42]；也有研究表明，在大腸桿菌感染的乳房炎中，鼠李糖乳桿菌GR-1能通過抑制NOD樣受體識(shí)別受體NLRP3及炎性體NLRC4的激活，顯著抑制由大腸桿菌引起的IL-1β和IL-18的升高[43]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌能對(duì)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激且不誘發(fā)炎癥反應(yīng)，如在人單核樹突狀細(xì)胞中，鼠李糖乳桿菌能在不引發(fā)炎癥的情況下刺激TNF-α的適量表達(dá)[44];WU等[34]研究發(fā)現(xiàn),用鼠李糖乳桿菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理能適當(dāng)刺激TNF-α的適量表達(dá)，有效緩減由大腸桿菌所導(dǎo)致的TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-8 mRNA表達(dá)的顯著上調(diào)，緩減炎癥反應(yīng)。

4 乳酸菌防治奶牛乳房炎的前景展望

4.1 乳酸菌對(duì)血乳屏障的作用效果及機(jī)制奶牛乳腺上皮細(xì)胞是組成乳腺的第一層細(xì)胞，不僅可以分泌乳汁還能對(duì)抗原產(chǎn)生先天性免疫反應(yīng)[45]。血乳屏障主要由內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織、基膜和上皮細(xì)胞構(gòu)成，相鄰的乳腺上皮細(xì)胞間的黏附復(fù)合物主要包括緊密連接(tight junction，TJ)、黏附連接(adhesion junction，AJ)和橋粒(desmosome)(圖2)，這些結(jié)構(gòu)控制著細(xì)胞之間的黏附，并將乳汁與血液分隔開，對(duì)維持上皮極性和調(diào)節(jié)屏障通透性起著重要作用。緊密連接是位于血乳屏障最頂端的特殊結(jié)構(gòu)，能夠限制水分子、離子和微生物的胞旁流動(dòng)[46]。動(dòng)物泌乳期間乳腺物質(zhì)不能通過緊密連接進(jìn)行滲透，但奶?；既榉垦缀?，病原菌及其內(nèi)毒素會(huì)破壞緊密連接結(jié)構(gòu)，使血液和乳汁中的物質(zhì)相互滲透[47]。Occludin、ZO-1和Claudins是血乳屏障最重要的緊密連接蛋白[48]，其表達(dá)量是體現(xiàn)血乳屏障完整性的重要指標(biāo)。

圖2 乳腺上皮細(xì)胞中的細(xì)胞-細(xì)胞黏附復(fù)合物[49]

大量研究證明，乳酸菌在增強(qiáng)腸上皮屏障功能方面發(fā)揮著重要作用[50]，類似血乳屏障，緊密連接也是腸上皮細(xì)胞間的主要連接方式，其中跨膜電阻值(trans epithellal electric resistance，TEER)是反映上皮屏障完整性的重要指標(biāo)，值越大屏障越致密完整。體內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠增強(qiáng)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin-1、Occluding和ZO-1等的表達(dá)、提高TEER以維持上皮屏障的完整性[51-55]。RUDOLF等[56]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌、雙歧桿菌和鏈球菌混合而成的組合益生菌能有效緩減急性腸炎導(dǎo)致的腸屏障損傷。KARCZEWSKI等[57]研究表明，十二指腸灌注植物乳桿菌能有效促進(jìn)人腸道緊密連接蛋白的表達(dá)。GUO等[50]以Caco-2單層上皮細(xì)胞為模型，探究得出嗜酸乳桿菌能有效緩減IL-1β導(dǎo)致的腸上皮屏障損傷。此外，自然殺傷細(xì)胞能保護(hù)腸上皮細(xì)胞屏障免受病原體侵襲，QIU等[58]認(rèn)為，植物乳桿菌能夠誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞轉(zhuǎn)移并分泌IL-22，緩減大腸桿菌導(dǎo)致的腸上皮屏障損傷。

奶牛血乳屏障是動(dòng)物乳腺防御病原菌入侵的第一道防線，起著重要的物理屏障和免疫防御作用[59]，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性直接關(guān)系到奶牛的乳腺健康及其對(duì)乳房炎致病菌的抵御能力。以上研究證實(shí)，乳酸菌能夠通過促進(jìn)腸道上皮緊密連接蛋白的表達(dá)，保護(hù)其屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性。因此，乳酸菌能否增強(qiáng)奶牛血乳屏障功能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)奶牛對(duì)乳房炎致病菌的有效防御值得深入探究。

4.2 口服乳酸菌緩減奶牛乳房炎傳統(tǒng)上乳腺和微生物之間被認(rèn)為嚴(yán)格存在“宿主-病原體”之間的互作關(guān)系，即微生物侵入乳腺組織會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)[60]。但最近的宏基因組學(xué)研究表明，健康乳腺的分泌物中含有不同細(xì)菌群的基因組標(biāo)記，這些微生物絕大部分與哺乳動(dòng)物的乳房炎無關(guān)，被稱為“共生乳腺微生物群”，此概念的出現(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)觀點(diǎn)“健康的乳腺內(nèi)無菌”提出了挑戰(zhàn)[22]。此外，不少研究證實(shí)從健康女性乳汁中可分離得到產(chǎn)氣乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和唾液乳桿菌等，并證明其具有與商業(yè)益生菌相似的益生性[61]。研究表明，乳酸菌可通過腸道上皮樹狀細(xì)胞的內(nèi)吞作用穿透小腸上皮，再沿腸-乳通路經(jīng)內(nèi)循環(huán)直接到達(dá)乳腺[62]。2018年，SHIVELY等[63]研究證明，飲食能夠改善乳腺微生物的組成，增加其中乳酸菌的豐度。TED等[64]用宏基因組學(xué)對(duì)人腸道和乳汁中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，得出腸道細(xì)菌可能源自乳汁，并提出腸道菌群的形成又會(huì)對(duì)乳腺菌群產(chǎn)生影響的結(jié)論。因此，口服乳酸菌可能具有優(yōu)化乳房內(nèi)微生物區(qū)系，進(jìn)而有效防治奶牛乳房炎的作用。

已經(jīng)證實(shí)，口服乳酸菌在治療女性乳房炎方面具有較好的效果。JIMENEZ等[65]研究發(fā)現(xiàn)，口服加氏乳桿菌能夠有效緩減患葡萄球菌性乳房炎女性的臨床癥狀。ARROYO等[66]研究表明，口服發(fā)酵乳桿菌和唾液桿菌后，患者乳樣中的平均細(xì)菌數(shù)顯著低于服用抗生素組，且其乳房炎癥狀明顯改善、復(fù)發(fā)率降低。LEONIDES等[67]研究結(jié)果顯示，給妊娠約30周至哺乳期間的孕婦口服唾液乳桿菌，其哺乳期3個(gè)月內(nèi)的乳房炎發(fā)病率和乳中的細(xì)菌數(shù)均顯著降低。

MA等[17]于2018年指出：通過奶牛到小鼠的跨物種糞菌移植，證實(shí)失調(diào)的腸道菌群可能是引發(fā)乳腺炎的原因之一，口服恢復(fù)腸道菌群功能的益生菌(如該研究使用的干酪乳桿菌)是潛在的治療策略。以上研究表明，口服乳酸菌能夠有效緩減女性或小鼠的乳房炎。但對(duì)于反芻動(dòng)物而言，目前還沒有關(guān)于通過口服的方式攝入乳酸菌，使其通過腸-乳途徑到達(dá)乳腺發(fā)揮作用的研究。因此，口服乳酸菌能否有效緩減奶牛乳房炎，又是通過何種途徑實(shí)現(xiàn)防治效果值得探索。

5 小結(jié)

乳房炎是奶牛發(fā)病率較高的常見疾病之一，給奶業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。奶牛臨床性乳房炎的治療主要依賴于抗生素，而抗生素濫用帶來的致病菌耐藥性傳播和抗生素殘留等問題給環(huán)境保護(hù)和食品質(zhì)量安全帶來巨大挑戰(zhàn)。作為抗生素的潛在替代品，乳酸菌在防治病原微生物方面很有潛力。研究表明，乳導(dǎo)管注射乳酸菌能夠有效防治奶牛的乳房炎，這可能是通過抑制致病菌的定植和黏附以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等途徑實(shí)現(xiàn)的。但乳腺正常狀態(tài)下較少受到微生物刺激，為有效規(guī)避乳酸菌自身誘發(fā)乳腺炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，在通過乳導(dǎo)管注射的方式防治奶牛乳房炎時(shí)，菌株選擇、宿主生理階段和用量等值得關(guān)注。此外，乳酸菌對(duì)血乳屏障的作用效果及機(jī)制，口服乳酸菌能否成為緩減奶牛乳房炎的有效途徑值得深入研究。