高海慧，王建東，康曉冬，王培柱，吳學(xué)青，李穎康*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002；2.寧夏吳忠市利通區(qū)扁擔(dān)溝鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，寧夏 吳忠 751100)

隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumspp.)是一種感染人類(lèi)和許多動(dòng)物的原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)。它是新生羔羊腹瀉的第二大誘因，僅次于輪狀病毒，隱孢子蟲(chóng)病現(xiàn)在被認(rèn)為是一種重要的疾病，可引起全世界新生反芻動(dòng)物的腹瀉[1]。全世界綿羊隱孢子蟲(chóng)感染的患病率為1.6%～77.4%[2-8]，山羊隱孢子蟲(chóng)感染的患病率為2.0%～72.5%[4-9]，各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的感染率不盡相同，感染率有差異的原因可能是動(dòng)物年齡、診斷方法、樣本量、動(dòng)物管理和氣候的不同。研究表明，隱孢子蟲(chóng)病在綿羊和山羊中不構(gòu)成一個(gè)主要的健康問(wèn)題，但受感染的動(dòng)物可能是人畜共患型隱孢子蟲(chóng)的宿主[10]，同時(shí)綿羊和山羊隱孢子蟲(chóng)病在人類(lèi)和家養(yǎng)反芻動(dòng)物幼崽的暴發(fā)中發(fā)揮重要作用，現(xiàn)今缺乏對(duì)牲畜的有效預(yù)防和治療[11]。小反芻動(dòng)物可能在隱孢子蟲(chóng)的傳播中起重要作用。對(duì)人類(lèi)而言，微小隱孢子蟲(chóng)，尤其是Ⅱd亞型是人類(lèi)的重要傳染源?，F(xiàn)就近年來(lái)寄生于羊的隱孢子蟲(chóng)種類(lèi)和基因型、感染隱孢子蟲(chóng)的危險(xiǎn)因素以及我國(guó)羊感染的現(xiàn)狀等研究作一綜述。

1 羊感染隱孢子蟲(chóng)的種類(lèi)和基因型

隱孢子蟲(chóng)是家畜、家禽、伴生動(dòng)物和野生動(dòng)物的病原體，對(duì)公眾健康構(gòu)成威脅[12]，許多大的隱孢子蟲(chóng)暴發(fā)事件都是由于水源被動(dòng)物糞便污染所引起的[13]。早期通過(guò)顯微鏡觀察，對(duì)寄生于羊的隱孢子蟲(chóng)感染種類(lèi)不能鑒別。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲(chóng)的有效種已達(dá)31個(gè)，基因型為70多個(gè)[11]，羊感染的隱孢子蟲(chóng)種類(lèi)/基因型呈多樣性，主要感染的蟲(chóng)種為微小隱孢子蟲(chóng)(C.parvum)、肖氏隱孢子蟲(chóng)(C.xiaoi)、泛在隱孢子蟲(chóng)(C.ubiquitum)、牛隱孢子蟲(chóng)(C.bovis)、人隱孢子蟲(chóng)(C.hominis)、安氏隱孢子蟲(chóng)(C.andersoni)、豬隱孢子蟲(chóng)(C.suis)、費(fèi)氏隱孢子蟲(chóng)(C.fayeri)、貝氏隱孢子蟲(chóng)(C.baileyi)、芮氏隱孢子蟲(chóng)(C.ryanae)和犬隱孢子蟲(chóng)(C.canis)[1,13-18]。C.parvum亞型包含ⅡaA20G1R1、ⅡaA15G2R1、ⅡaA17G2R1、ⅡaA14G2R1、ⅡaA13G1R1、ⅡdA-19G1、ⅡdA23G1、ⅡdA17G1、ⅡdA14G2、ⅡdA15-G1、ⅡdA16G1和ⅡdA18G1[19-23]。綿羊較易感染C.parvumⅡa亞型，山羊較易感染C.parvumⅡd亞型[23]。C.xiaoi、C.ubiquitum在山羊中廣泛流行，C.parvum是綿羊的主要感染種[16]。我國(guó)C.xiaoi感染率最高，C.ubiquitum次之，然后是C.parvum，也有檢出C.andersoni[18]。3月齡以?xún)?nèi)的綿羊感染的基因型均為C.parvum，3月齡以上的有C.andersoni、C.parvum,這也證實(shí)了綿羊和牛一樣只有大齡動(dòng)物更易感染C.andersoni[24]。

2 羊感染隱孢子蟲(chóng)的危險(xiǎn)因素

養(yǎng)殖方式(散養(yǎng)或圈養(yǎng))是羊感染隱孢子蟲(chóng)的危險(xiǎn)因素。QI等[15]研究表明，散養(yǎng)飼養(yǎng)的模式下成年羊的感染率低；MAHFOUZ等[25]研究顯示，羊感染隱孢子蟲(chóng)存在很大的地域差異，與牧場(chǎng)管理和飼養(yǎng)方法不同有關(guān)。對(duì)隱孢子蟲(chóng)卵囊進(jìn)行齊-尼染色法(ZN)和抗原酶免疫測(cè)定(EIA)，結(jié)果EIA檢測(cè)的陽(yáng)性率高于ZN，小于3月齡的綿羊和山羊陽(yáng)性率高，封閉圈舍飼養(yǎng)是隱孢子蟲(chóng)感染的危險(xiǎn)因素[26]。

隱孢子蟲(chóng)感染牛的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素有飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生、飼料源、水源、腹瀉、家畜混合飼養(yǎng)，衛(wèi)生狀況差的感染率是衛(wèi)生狀況好的牧場(chǎng)的3倍，飲用水為河水的感染率是自來(lái)水的3倍，飼料來(lái)源影響隱孢子蟲(chóng)的發(fā)病率，腹瀉的感染率是正常的3倍，家畜混合飼養(yǎng)的感染率高于單獨(dú)飼養(yǎng)[27]，在牛羊中檢測(cè)到同種的隱孢子蟲(chóng)亞型，表明隱孢子蟲(chóng)在動(dòng)物之間的傳遞性[15]，牛羊的混合飼養(yǎng)是羊容易患隱孢子蟲(chóng)病的危險(xiǎn)因素。隱孢子蟲(chóng)在小型反芻動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)中分布廣泛(47.4%～50.0%)，但在山羊和綿羊2種寄主中患病率較低(5.9%～6.0%)，混合飼養(yǎng)羊的感染率有所增加[16]。在愛(ài)爾蘭利菲河流域馬糞便中也發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了C.ryanae、C.bovis和C.xiaoi，具有牛和羊宿主特異性的隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種，羊同馬、牛一起放牧?xí)黾友蚧茧[孢子蟲(chóng)的幾率[28]。

飼養(yǎng)衛(wèi)生條件是潛在危險(xiǎn)因素之一，不好的衛(wèi)生條件增加動(dòng)物的隱孢子蟲(chóng)感染率，擴(kuò)大隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種的傳播[29]，衛(wèi)生條件差的牧場(chǎng)為隱孢子蟲(chóng)卵囊提供了良好的生存環(huán)境。一些衛(wèi)生條件較好的牧場(chǎng)和圈舍隱孢子蟲(chóng)感染率明顯低于衛(wèi)生狀況差的牧場(chǎng)和圈舍;飼養(yǎng)密度大的圈舍,感染率高,這可能是密度大的圈舍中散布的卵囊也較多,傳播的速度也更快[24]。DELAFOSSE 等[30]建立2個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素模型，分析得出奶山羊羔羊初生的幾個(gè)小時(shí)母羊圈舍的環(huán)境是傳播C.parvum的風(fēng)險(xiǎn)途徑，與感染率高相關(guān)的因素還包括調(diào)查時(shí)間和圈舍的通風(fēng)類(lèi)型。

對(duì)于放牧的散養(yǎng)羊,季節(jié)變化對(duì)于其隱孢子蟲(chóng)感染率的高低可能有較大的影響,徐洪忠等[31]報(bào)道,因秋冬季節(jié)飼草匱乏而造成山羊的感染率較高 (56.7%) 。但對(duì)于規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng),并不存在草料短缺的危險(xiǎn)。感染率隨季節(jié)變化波動(dòng)不大,僅在春末秋初產(chǎn)仔高峰期感染率略有提高[24]。MI等[21]研究我國(guó)大部分綿羊飼養(yǎng)的地區(qū)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)季節(jié)都能檢測(cè)到了隱孢子蟲(chóng)，其中秋季的患病率最高，但未發(fā)現(xiàn)綿羊年齡組或季節(jié)之間的任何差異，發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種分布因省和農(nóng)場(chǎng)而異，綿羊可能是人畜共患隱孢子蟲(chóng)病的潛在來(lái)源。春季的感染率(40.0%) 遠(yuǎn)高于秋季的感染率(8.0%)[32]。

在臨床上隱孢子蟲(chóng)病的嚴(yán)重程度受動(dòng)物的年齡、免疫和營(yíng)養(yǎng)水平的影響[33]。綿羊隱孢子蟲(chóng)感染與綿羊飼養(yǎng)環(huán)境和機(jī)體免疫力不同有關(guān)，各地報(bào)道感染情況存在較大差異[34-35]。分娩前后母羊的免疫力較低,感染率(5.26%) 高于其他成年羊，以2～3月齡羔羊、產(chǎn)后1月和懷孕2月左右母羊的感染率較高，表明山羊隱孢子蟲(chóng)感染存在年齡、體況等差異，可能與孕產(chǎn)期前后母羊免疫力下降有關(guān)[24]。有研究表明，檢測(cè)到的發(fā)病率較低，可能是由于斷奶后和成年小反芻動(dòng)物的間歇性卵囊排泄有關(guān)[27]。

AGNIESZKA等[36]發(fā)現(xiàn)，感染率在研究年齡組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但隨著年齡的增加，羊隱孢子蟲(chóng)的感染率呈上升趨勢(shì)，動(dòng)物的品種、年齡或性別對(duì)小反芻動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)的流行率沒(méi)有顯著影響[37]。羔羊感染隱孢子蟲(chóng)不表現(xiàn)性別和年齡的差異[38]，羊的隱孢子蟲(chóng)感染存在地區(qū)差異，不同地區(qū)感染規(guī)律存在差異，認(rèn)為羊的年齡、品種、性別不作為羊感染隱孢子蟲(chóng)的主要危險(xiǎn)因素。

3 隱孢子蟲(chóng)感染的檢測(cè)方法

分子方法的應(yīng)用在隱孢子蟲(chóng)的流行病學(xué)研究上取得了重大進(jìn)展。分子方法可以有效地進(jìn)行人獸共患的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，進(jìn)行蟲(chóng)種、基因分型、溯源的相關(guān)研究，是目前最可靠、靈敏、便捷的方法[39]。目前，檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)感染的方法有分子生物學(xué)、免疫學(xué)和病原形態(tài)學(xué)等。分子生物學(xué)方法主要有常規(guī)PCR、套式PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR、LAMP技術(shù)、PCR-限制性片段多態(tài)性分析(PCR-RFLP)等。免疫學(xué)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)以及流式細(xì)胞術(shù)等方法。病原形態(tài)學(xué)主要方法是飽和蔗糖漂浮法、改良抗酸染色法、Kinyoun染色法等技術(shù)。比較抗酸染色法、直接熒光抗體檢測(cè)(DFAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和分子生物學(xué)方法(套式PCR)，對(duì)無(wú)臨床癥狀羊隱孢子蟲(chóng)的篩選建議選用套式PCR[40]。免疫學(xué)方法敏感性高,但它對(duì)抗原要求較高,且很難區(qū)分卵囊是否具有感染性。PCR及其衍生技術(shù)的應(yīng)用極大地提高了隱孢子蟲(chóng)的檢出率[41]。免疫學(xué)方法檢測(cè)水、糞便中隱孢子蟲(chóng)卵囊敏感性和特異性要低于PCR方法[42]。

4 我國(guó)羊隱孢子蟲(chóng)感染情況

4.1 華東地區(qū)飽和蔗糖溶液漂浮法檢測(cè)506份樣本，隱孢子蟲(chóng)感染率較低，為0.20% (1/506)[43]。在安徽省和鄰近省份(山東、河南、江蘇)，檢測(cè)方法不同獲得結(jié)果有明顯差異，利用形態(tài)學(xué)方法觀察腸道寄生蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)綿羊隱孢子蟲(chóng)感染率為0.00%(0/832)，山羊隱孢子蟲(chóng)感染率為0.26%(2/781)，安徽地區(qū)隱孢子蟲(chóng)感染率為0.00%，山東地區(qū)1.19%[44]?；赟SU rDNA基因開(kāi)展巢氏PCR，綿羊的隱孢子蟲(chóng)的總體患病率為5.8%(48/832)，山羊的總體患病率為8.7%(68/781)。在安徽省和其鄰近省份，綿羊的隱孢子蟲(chóng)的總體患病率為5.8%(48/832)，山羊的總患病率為8.7%(68/781)；鑒定出綿羊的感染蟲(chóng)種為C.xiaoi和C.ubiquitum，山羊的感染蟲(chóng)種為C.parvum，分型研究發(fā)現(xiàn)C.ubiquitum都屬于XⅡa亞型，而C.parvum的屬于ⅡdA19G1亞型[22]。山東省滕州市采用PCR擴(kuò)增隱孢子蟲(chóng)actin基因，總的感染率為6.76%，其中綿羊感染率7.84%，山羊感染率5.83%，C.parvum檢出率最高為53.33%，其次是C.xiaoi為40.00%，C.ubiquitum為6.67%[45]。對(duì)贛西地區(qū)312份山羊糞便通過(guò)形態(tài)學(xué)檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)感染率為17.95%，腸道寄生蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種是球蟲(chóng)和線蟲(chóng)[46]。

4.2 西北地區(qū)寧夏回族自治區(qū)吳忠市羊隱孢子蟲(chóng)總的感染率為28.30%,其中綿羊感染率為33.8%,山羊感染率為22.9%，C.xiaoi為優(yōu)勢(shì)種，有C.ubiquitum和C.parvum感染。春季感染率最高(49.2%),夏季最低(6.7%)，未斷奶羔羊感染率最高(34.4%),而成年羊感染率最低(19.4%)[47]。陜北黑山羊隱孢子蟲(chóng)的感染率為14.0%，檢出7份C.bovis和6份C.xiaoi，C.xiaoi各個(gè)年齡段均可感染，除7～12月齡的其他年齡段黑山羊均有C.bovis感染，主要存在6月齡以?xún)?nèi)的羊[48]。甘肅藏綿羊的隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率為4.5%，只發(fā)現(xiàn)C.ubiquitum，通過(guò)GP60檢測(cè)全部為人畜共患Ⅻa亞型[49]。羊在青藏高原東北部的部分地區(qū)隱孢子蟲(chóng)感染率為6.15%，得到C.parvum和C.canis各2株[17]。青海藏綿羊12.3%為隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性，C.xiaoi檢出率為90.7%，C.ubiquitum檢出率為9.3%，C.ubiquitum為Ⅻa亞型[50]。新疆地區(qū)綿羊隱孢子蟲(chóng)感染率為0.9%，得到C.xiaoi、C.ubiquitum、C.parvum各1株[15]。

4.3 華中地區(qū)運(yùn)用飽和蔗糖溶液漂浮法的檢測(cè)結(jié)果顯示，河南省鄭州市等6個(gè)市綿羊隱孢子蟲(chóng)的感染率為1.60%，僅見(jiàn)于1歲以下綿羊感染[51]。PCR方法檢測(cè)河南省1 071份綿羊糞便樣品，隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率為4.82%，發(fā)現(xiàn)C.andersoni、C.xiaoi、Cryptosporidiumcervinegenotype，Cryptosporidiumcervinegenotype均可感染每個(gè)年齡綿羊，如C.xiaoi可感染羔羊,C.andersoni可感染母羊[21]。河南省和陜西省檢查11份腸道寄生蟲(chóng)病樣本，隱孢子蟲(chóng)感染率為0.3%[52]。河南省登封和開(kāi)封地區(qū)的82份糞便樣品陽(yáng)性率為8.54%[24]。河南省通過(guò)形態(tài)學(xué)方法調(diào)查4個(gè)規(guī)?；蝠B(yǎng)殖場(chǎng)，隱孢子蟲(chóng)的陽(yáng)性率為0.9%，湖羊消化道寄生蟲(chóng)混合感染率為75.23%,混合感染普遍且混合感染率高[53]。河南省844份山羊糞便樣品，隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率為1.8%[54]，316份奶山羊樣本，隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率為0.3%，主要檢出蟲(chóng)種為球蟲(chóng)和線蟲(chóng)[50]。

4.4 華北地區(qū)內(nèi)蒙古4個(gè)年齡段綿羊中妊娠期母羊隱孢子蟲(chóng)感染率(7.8%)明顯高于妊娠前1周(1.7%)。羔羊的感染率(3～4周齡)、(15～16周齡)分別為18.4%和26.7%，發(fā)現(xiàn)人畜共患病隱孢子蟲(chóng)種C.parvum(ⅡaA15G2R1亞型)1株[20]。呼和浩特地區(qū)51份山羊糞便中隱孢子蟲(chóng)的陽(yáng)性率為2.0%[54]。羊體內(nèi)存在多個(gè)隱孢子蟲(chóng)種類(lèi)和基因型，其中某些種類(lèi)屬于人獸共患種，具有非常重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，是人隱孢子蟲(chóng)病暴發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)[48-49]。

4.5 西南、東北地區(qū)重慶市山羊隱孢子蟲(chóng)平均感染率為5.32%[55]。飽和鹽水漂浮法檢測(cè)四川省宜賓市2個(gè)山羊場(chǎng)隱孢子蟲(chóng)感染率為9.90%，感染的寄生蟲(chóng)主要是球蟲(chóng)和線蟲(chóng)[56]。黑龍江省齊齊哈爾地區(qū)8個(gè)縣 (區(qū)) 517份樣本(部分為半舍飼，部分為純放牧飼養(yǎng))隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率為5.26%[57]。

5 展望

隱孢子蟲(chóng)被廣泛認(rèn)為是家畜、家禽、伴生動(dòng)物和野生動(dòng)物的病原體，對(duì)公眾健康構(gòu)成威脅。隱孢子蟲(chóng)是世界范圍內(nèi)反芻家畜常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)，我國(guó)不同地區(qū)山羊和綿羊的隱孢子蟲(chóng)感染率差異較大，總體感染率為0.3%～72.0%，這可能是由于動(dòng)物年齡、品種、采樣數(shù)量、牧場(chǎng)管理、檢測(cè)方法等所造成的。在華南地區(qū)鮮有報(bào)道，多集中在西北和華中地區(qū)。綜上所述，季節(jié)、養(yǎng)殖場(chǎng)衛(wèi)生情況、飼養(yǎng)方式、是否封閉圈舍飼養(yǎng)、是否同其他小反芻動(dòng)物混養(yǎng)、羊只自身免疫力等都是羊感染隱孢子蟲(chóng)的危險(xiǎn)因素。

近年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)取得了較快的發(fā)展，隨著人們生活水平的提高，對(duì)肉食品多樣性需求越來(lái)越高，而羊肉中蛋白質(zhì)和必需氨基酸顯著高于豬肉、雞肉和牛肉，隨著產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整步伐的加快，養(yǎng)羊業(yè)比重不斷增加，已成為推動(dòng)我國(guó)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)。隱孢子蟲(chóng)糞便脫落可能與羊生長(zhǎng)緩慢和腹瀉有關(guān)[58]，這對(duì)羊的生產(chǎn)管理提出更高的要求。研究羊隱孢子蟲(chóng)的防治方法，可以減少對(duì)羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)利潤(rùn)、動(dòng)物福利和公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)的不利影響。隨著肉用反芻動(dòng)物養(yǎng)殖數(shù)量及規(guī)模越來(lái)越大，研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些新的隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種和新的宿主，因此有必要將隱孢子蟲(chóng)納入常規(guī)監(jiān)測(cè)體系[59]。

目前還沒(méi)有完全有效的方法治療隱孢子蟲(chóng)感染，因此養(yǎng)殖場(chǎng)需要加強(qiáng)預(yù)防，注意飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生，提高飼養(yǎng)管理水平，做好圈舍衛(wèi)生定期消毒，保持圈舍干燥干凈，在養(yǎng)殖過(guò)程中飼養(yǎng)人員注重個(gè)人防護(hù)，做好糞便處理工作，避免造成對(duì)水源的污染[60]。