李富祥，趙文華，宋建領(lǐng)，朱建波，楊仕標(biāo)

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224)

里默桿菌屬于黃桿菌綱(Flavobacteriia)、黃桿菌目(Flavobacteriaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriales)、里默桿菌屬(Riemerella),該屬包括鴨疫里默桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)和鴿里默桿菌(Riemerellacolumbina，RC)、鴿咽喉里默桿菌(Riemerellacolumbipharyngis)3個種。其中，RA呈世界性分布，主要感染鴨，鵝、火雞和其他鳥類感染較少見[1-2]，雞RA感染十分罕見[3]。RA感染又稱新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合征、鴨疫敗血癥和傳染性漿膜炎，該病廣泛分布于世界各國。我國郭玉璞等[4]于1982年首次分離到鴨源RA，之后諸多省份均有RA感的報道，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，我國福建[5]、江蘇[6]和廣東[7-8]等省份均有鵝源RA分離鑒定的報道。到目前為止，未見我國雞源RA分離鑒定的報道。

2020年1月，云南省昆明市某養(yǎng)雞場仔雞(鐵腳麻)發(fā)生一種臨床癥狀以精神沉郁、呼吸困難、咳嗽、打噴嚏、鼻腔有大量黏液性分泌物為特征，病理變化以嚴(yán)重腹水、心包炎和肝周炎為特征的病例。該病發(fā)病率為15.0%，病死率為46.7%，給養(yǎng)殖場造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。為查明病因，我們對該病例進(jìn)行細(xì)菌學(xué)診斷，從病死雞肝臟分離到8株革蘭陰性多形桿菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rDNA分析鑒定為RA。本試驗還對8株雞源RA分離株ompA基因(outer membrane protein A gene，ompA)及其推導(dǎo)的蛋白(outer membrane protein A，OmpA)序列遺傳進(jìn)化特征進(jìn)行分析，為我國雞源RA感染的防制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix和Trans 2k DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；青霉素、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻吩、頭孢克羅、頭孢噻肟、卡那霉素片、慶大霉素、氧氟沙星、磺胺甲噁唑藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；氟苯尼考藥敏紙片購自英國OXOID公司。

1.2 菌株10株云南鴨源RA分離株RA-1、RA-2、RA-3、RA-10、RA-22、RA-23、RA-33、RA-36、RA-37和RA-39由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保藏。

1.3 引物設(shè)計細(xì)菌16S rDNA上游引物27F(A) 和下游引物1492R(T)按參考文獻(xiàn)[9]設(shè)計；ompA基因上游引物Pf和下游引物Pr按參考文獻(xiàn)[10]設(shè)計；2對引物均由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

1.4 病理剖檢將病死雞剖檢，觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、輸卵管等病理變化，同時采集肝臟樣品，4℃ 保存，用于細(xì)菌分離鑒定。

1.5 細(xì)菌分離取肝臟劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，挑單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，挑取菌落制作涂片，革蘭染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)。同時將分離株接種麥康凱瓊脂平板，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，觀察生長特性。

1.6 16S rDNA和ompA基因測序用細(xì)菌基因組提取試劑盒分別提取各雞源分離株以及10株云南鴨源RA分離株RA-1、RA-2、RA-3、RA-10、RA-22、RA-23、RA-33、RA-36、RA-37和RA-39的基因組DNA作為模板，采用引物27F和1492R PCR擴(kuò)增16S rDNA基因，采用引物Pf和Pr PCR擴(kuò)增ompA基因。PCR反應(yīng)條件均為：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測序，提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得基因收錄號。

1.7 16S rDNA進(jìn)化分析將8株雞源RA分離株16S rDNA基因在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blust比對，并下載不同國家和地區(qū)、不同分離源動物(鴨和鵝)參考株的基因序列共28個，用Clustal_X 1.83軟件進(jìn)行多序列比對分析，用MEGA 4.0.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Neighbor-Joining方法，bootstrap values值設(shè)定為1 000)，選擇黃桿菌科模式菌株Flavobacterium aquatile LMG4008作為進(jìn)化樹的外群。用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸序列比對，分析16S rDNA基因的同源性。

1.8ompA基因進(jìn)化分析將8株雞源RA分離株ompA基因在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blust比對，并下載不同國家和地區(qū)、不同分離源動物(鴨和鵝)參考株的基因序列共28個，用Clustal_X 1.83軟件進(jìn)行多序列比對分析，用MEGA 4.0.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Neighbor-Joining方法，bootstrap values值設(shè)定為1 000)。用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸序列比對，分析ompA基因的同源性。

1.9 OmpA蛋白序列進(jìn)化分析用DNAstar軟件包中的EditSeq軟件將8株雞源RA分離株ompA基因序列推導(dǎo)為蛋白序列，將雞源分離株OmpA蛋白序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blust比對，并下載不同國家和地區(qū)、不同分離源動物(鴨和鵝)參考株的基因序列共27個，用Clustal_X 1.83軟件進(jìn)行多序列比對分析，用MEGA 4.0.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Neighbor-Joining方法，bootstrap values值設(shè)定為1 000)。用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件進(jìn)行蛋白序列比對，分析OmpA蛋白的同源性。

1.10 藥敏試驗參考文獻(xiàn)[11]和 CLSI20015 推薦的 Kirby- Bauer方法，測定各分離株對10種抗菌藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢將病死雞剖檢，可見全部8只病死雞病理變化一致，均表現(xiàn)為腹部膨大，內(nèi)有大量淡黃色漿液；心包膜表面有大量淡黃色纖維蛋白附著；肝臟表面有大量淡黃色纖維蛋白附著(圖1)。

圖1 心包膜和肝臟表面有大量纖維蛋白附著

2.2 細(xì)菌分離8份雞肝臟病料分別劃線接種營養(yǎng)瓊脂，37℃培養(yǎng)過夜后，均長出大量純粹灰白色中等大小菌落，菌落凸起、濕潤、光滑、邊緣整齊。分別挑單菌落純培養(yǎng)后分離到8株雞源細(xì)菌，編號分別為RA-20011、RA-20012、RA-20013、RA-20014、RA-20015、RA-20016、RA-20017和RA-20018，8株分離株革蘭染色均呈陰性多形桿菌(圖2)。8株雞源分離株在麥康凱瓊脂上均不生長。

圖2 分離株革蘭染色形態(tài)(1 000×)

2.3 16S rDNA和ompA基因測序8株雞源分離株16S rDNA基因和ompA基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分別得到約為1 500 bp，和1 200 bp的條帶，與預(yù)期的1 500，1 154 bp相符，鑒定正確。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得基因登錄號。8株雞源分離株16S rDNA基因登錄號分別為MT367923～MT367930，ompA基因登錄號分別為MT380216～MT380223。9株云南鴨源RA分離株(RA-23基因序列未提交)16S rDNA基因登錄號分別為MT367914～MT367922，10株云南鴨源RA分離株ompA基因登錄號分別為MT380206～MT380215。

2.4 16S rDNA進(jìn)化分析系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，8株雞源分離株與22株RA參考株形成一個大的進(jìn)化分支(圖3)，8株雞源分離株與22株RA參考株之間的同源性為98.8%～100.0%，與RA模式菌株ATCC11845之間的同源性為99.3%～99.8%。8株分離株形成一個小的進(jìn)化分支(圖3)，之間的同源性為99.7%～100.0%。3株R.columbipharyngis形成第2個大的進(jìn)化分支(圖3)。3株R.columbina形成第3個大的進(jìn)化分支(圖3)。8株雞源分離株與R.columbipharyngis和R.columbina分離株間的同源性為96.3%～96.4%。進(jìn)化分析表明，8株雞源分離株與RA模式菌株ATCC11845以及其他RA參考株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系最近，與R.columbipharyngis和R.columbina分離株遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，將8株分離株鑒定為RA。

圖3 16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5ompA基因進(jìn)化分析系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，8株雞源RA分離株與3株印度鴨源分離株KML1、KML2、KML3以及1株中國臺灣地區(qū)鵝源分離株KS9901-G形成一個大的進(jìn)化分支(圖4)，與KML1、KML2、KML3、KS9901-G之間的同源性為94.0%～99.6%，其遺傳進(jìn)化關(guān)系最近。8株雞源RA分離株形成一個獨立的小進(jìn)化分支(圖4)，之間的同源性為100%。其他19株鴨源RA和5株鵝源RA分離株形成另一個大的進(jìn)化分支(圖4)，與8株雞源RA分離株之間的同源性為88.1%～93.6%，與8株雞源RA分離株間的遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。與模式菌株ATCC11845相比較，8株雞源RA分離株ompA基因均發(fā)生99個核苷酸位點的突變。

2.6 OmpA蛋白序列進(jìn)化分析系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，8株雞源RA分離株形成第1個大的進(jìn)化分支(圖5)，之間的同源性為100%。3株印度鴨源分離株KML1、KML2和KML3形成第2個大的進(jìn)化分支(圖5)，之間同源性為96.0%～99.7%。1株中國臺灣地區(qū)鵝源分離株KS9901-G形成第2個獨立大的進(jìn)化分支(圖5)。其他RA參考株形成第4個大的進(jìn)化分支(圖5)，之間的同源性為92.3%～100%。8株雞源RA分離株與鴨源分離株之間的同源性為90.6%～96.9%，與鵝源分離株之間的同源性為92.3%～99.4%，其中與鵝源分離株KS9901-G之間的同源性為99.4%，遺傳進(jìn)化關(guān)系最近。與RA模式菌株ATCC11845相比較，8株雞源RA分離株OmpA蛋白均發(fā)生19個核苷酸位點的突變。

2.7 藥敏試驗藥敏試驗結(jié)果顯示，8株雞源RA分離株對青霉素、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻吩、頭孢克羅、頭孢噻肟、卡那霉素片、慶大霉素、氧氟沙星、磺胺甲噁唑和氟苯尼考均敏感。

3 討論

RA病呈世界分布，嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。鵝RA感染時有報道，雞RA感染報道十分罕見。

圖4 ompA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 OmpA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

病鴨和病鵝病理特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎。本研究從一起纖維素性心包炎、肝周炎和嚴(yán)重腹水雞病例中分離到RA，證實了我國雞RA感染的存在。本研究中雞病例纖維素性心包炎、肝周炎病理特征與鴨、鵝鴨疫RA感染的病理特征相似，但在本試驗雞病例中，約80%病雞還表現(xiàn)出了嚴(yán)重的腹水病理特征，此特征與鴨和鵝鴨疫RA感染的病理特征不同。本研究中的8株雞源RA(RA-20011、RA-20012、RA-20013、RA-20014、RA-20015、RA-20016、RA-20017和RA-20018)能夠自然感染雞，導(dǎo)致漿膜炎特征病變和死亡，可能與分離株的宿主嗜性發(fā)生改變相關(guān)。本試驗在我國分離到雞源RA，并系統(tǒng)報道雞源RA自然感染的臨床癥狀和病理變化特征，以及雞源RA的培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)特征和藥物敏感性。8株雞源RA分離株對阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻吩等10種抗菌藥物敏感，選擇阿莫西林克拉維酸鉀對該起病例進(jìn)行治療，效果良好。

16S rDNA基因鑒定試驗中，8株雞源RA分離株與其他全部22株RA參考株形成第1個大的進(jìn)化分支，8株雞源分離株與22株RA參考株之間的同源性為98.8%～100.0%，與RA模式菌株ATCC11845之間的同源性為99.3%～99.8%；另外16S rDNA基因Blust比較結(jié)果顯示，8株雞源分離株與全部100株RA參考株間的同源性為99.3%～99.9%，具有很高的同源性，16S rDNA基因分析數(shù)據(jù)結(jié)合分離株的菌落、菌體形態(tài)學(xué)特征，最終將8株分離株鑒定為RA。

ompA基因Blust比較結(jié)果顯示，8株雞源RA分離株與3株印度鴨源分離株KML1、KML2 KML3以及1株我國臺灣鵝源分離株KS9901-G之間的同源性為97.9%～99.7%，與其他RA參考株間的同源性均小于94%。進(jìn)化分析顯示,8株雞源RA分離株與3株印度鴨源分離株KML1、KML2 KML3以及1株我國臺灣地區(qū)鵝源分離株KS9901-G形成一個大的進(jìn)化分支，與KML1、KML2 KML3、KS9901-G之間的同源性為94.0%～99.6%，其遺傳進(jìn)化關(guān)系最近。由此推測RAompA基因進(jìn)化與分離來源地域(印度、中國大陸、中國臺灣地區(qū))和宿主種類(雞、鴨、鵝)無相關(guān)性，此結(jié)論與參考文獻(xiàn)[12] 的報道相一致。

OmpA蛋白Blust比較結(jié)果顯示，8株雞源RA分離株與1株我國臺灣地區(qū)鵝源分離株KS9901-G之間的同源性為99.7%，與其他RA參考株間的同源性均小于97%。進(jìn)化分析顯示，4株中國臺灣地區(qū)鵝源RA分離株27A、PT0001-G、PT9101和PT9901位于第4個大的進(jìn)化分支中，而另1株中國臺灣地區(qū)鵝源分離株KS9901-G位于第3個大的進(jìn)化分支中，由此推測RA OmpA蛋白進(jìn)化與分離來源地域不具有相關(guān)性，此結(jié)論與參考文獻(xiàn)[12] 的報道相一致。8株雞源RA分離株形成一個獨立的大的進(jìn)化分支，由此推測RA OmpA蛋白進(jìn)化與宿主種類(雞、鴨、鵝)具有一定的相關(guān)性，此結(jié)論與參考文獻(xiàn)[12] 的報道相一致，其原因可能是由于參考文獻(xiàn)[12]的OmpA蛋白進(jìn)化分析所用菌株僅包括鴨源和鵝源RA分離株，不包含雞源RA分離株。