張 楠 張子英 王學(xué)梅 遲寶峰 蘇志剛 曹曉東

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院慢性病分子流行病實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)GLP中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110

瞿麥（Dianthus superbus L）是傳統(tǒng)的蒙醫(yī)常用藥之一。蒙藥名為高優(yōu)-巴沙嘎，屬石竹科多年生草本植物[1]。臨床應(yīng)用廣泛，在玉簪清咽十五味散（丸）、肋柱花四味湯散、楓香脂十味丸、清肝九味散、沉香安神散等中均含有瞿麥[2]。研究表明，瞿麥具有興奮子宮、抑制細胞毒性、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗氧化、抗腫瘤及利尿等作用[3]；在抗肝病毒、止痛、擴張血管、降低血壓及興奮腸管等方面也具有積極影響[2，4]。

關(guān)于瞿麥所產(chǎn)生的生物效應(yīng)及機制研究，目前國內(nèi)外主要關(guān)注的是化學(xué)成分及其藥理作用[4]。張建梅等[5]發(fā)現(xiàn)，栝樓瞿麥丸對糖尿病腎病大鼠腎臟有一定的保護作用。鄭桂敏等[6]用加減瓜蔞瞿麥丸治療復(fù)發(fā)性尿路感染的患者時發(fā)現(xiàn)，與應(yīng)用呋喃妥因治療的患者相比，加減瓜蔞瞿麥丸有一定的療效且可有效控制復(fù)發(fā)率，并能改善患者細胞免疫功能。

據(jù)國內(nèi)外文獻報道，目前從瞿麥中分離得到的化合物主要有皂苷類[7]、環(huán)肽類[8]、黃酮類、蒽醌類及有機酸類等，還含有少量的揮發(fā)油類、生物堿類[9]。根據(jù)文獻研究，皂苷具有肝臟毒性、腎臟毒性、胃腸道毒性、心臟毒性、遺傳毒性等[10-14]。蒽醌對腎、皮膚、膀胱、脾、甲狀腺、肝等有毒性作用[11]。同樣，含有皂苷和蒽醌類等成分的瞿麥可能也存在毒性。

通過上述文獻報道發(fā)現(xiàn)，有關(guān)瞿麥的毒理作用研究十分少見，在《中華人民共和國藥典（2015版）》[15]中也缺乏相關(guān)毒性作用的記載，且未見相關(guān)機制的研究。但是，研究瞿麥的毒理作用有助于推廣該藥的廣泛應(yīng)用，使臨床應(yīng)用更加合理。鑒于此，本研究通過短期給藥探索瞿麥對小鼠的潛在毒性作用，初步探討引起潛在毒性的劑量、靶器官和毒性機制，為瞿麥安全性評價提供科學(xué)依據(jù)，為臨床用藥提供安全信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康的清潔級昆明種成年小鼠，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[批準(zhǔn)號：SCXK（蒙） 2015-0001]，18～ 22 g，雌雄各半，隨機分為四組，每組各10只。

1.1.2 實驗試劑及儀器 瞿麥（河北萬修藥業(yè)有限公司），生理鹽水（江西科達衛(wèi)生用品公司），蘇木精-伊紅染色液（安徽雷根生物技術(shù)有限公司），甲醛（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），總RNA小量制備試劑盒（Axygen公司），cDNA制備試劑盒（Vazyme公司），熒光染料（羅氏）。

1.2 實驗方法

1.2.1 瞿麥水煎劑的制備 稱取50 g瞿麥，加入超純水，大火煎開后轉(zhuǎn)小火煎1 h，濾出藥液，同樣方法煎第2次，兩次藥液混勻后，蒸發(fā)濃縮。

1.2.2 實驗動物分組與染毒 劑量設(shè)計采用臨床劑量法（ACD法）：根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)定，成人瞿麥每日用量為9～15 g，按成人標(biāo)準(zhǔn)體重60 kg算，本實驗設(shè)計的瞿麥高劑量為2.5 g/ml大約相當(dāng)于臨床劑量的30倍。在該劑量下設(shè)定低、中劑量為0.25、0.5 g/ml，分別約相當(dāng)于臨床劑量的5、10倍。臨床上瞿麥的給藥途徑通常為口服，而本實驗考慮到胃內(nèi)容物對藥物劑量的影響以及藥物在胃內(nèi)的首過消除效應(yīng)，為確保給予實驗動物的藥物劑量準(zhǔn)確，故選擇腹腔注射途徑給藥。

40只昆明種小鼠隨機分為瞿麥水煎劑高、中、低劑量組，空白對照組，每組各10只。瞿麥水煎劑各劑量組每日腹腔注射給藥1次，空白對照組腹腔注射給予同體積生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。

1.2.3 實驗動物的一般觀察 實驗過程中每日給藥前后對小鼠的行為、活動、飲食飲水、毛色、糞便等變化進行觀察，并觀察注藥后小鼠的中毒反應(yīng)。

1.2.4 肝、腎功能測定 眼眶靜脈叢取血至離心管，以2500 r/min，離心15 min后取上清液，用全自動生化儀進行血液肝、腎功能檢測。

1.2.5 實驗動物處理及取材 脫頸椎處死后稱重，解剖暴露肝、腎、肺、脾臟，將其完整剝離，用生理鹽水沖洗以去除殘留血液，將其浸泡于10%甲醛溶液中固定。

1.2.6 臟器指數(shù)測定 用電子天平準(zhǔn)確稱量小鼠體重及肝、腎、肺、脾臟濕質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)，并用肝、腎、肺、脾臟重量/體重，分別計算各臟器指數(shù)。

1.2.7 組織病理學(xué)檢測 制作組織病理切片，蘇木精 -伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色法染色，封片光鏡觀察，在光學(xué)顯微鏡目鏡10×，物鏡10×、20×、40×下觀察組織學(xué)變化。

1.2.8 腎組織總RNA的提取、cDNA的制備及qPCR檢測 按照 Axygen公司總RNA小量制備試劑盒說明書提取組織RNA；按照Vazyme公司HiscriptQRTSSuperMix試劑盒說明，獲得cDNA?？俁NA上樣量為2.0 μl（約500 ng），反應(yīng)條件：25 ℃，10 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min。實時熒光定量PCR以制備的cDNA為模板，利用合成的特異性引物，通過qPCR方法擴增GAPDH、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1（OAT1）和有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白3（OAT3）的基因。反應(yīng)條件是預(yù)變性95 ℃10 s，變性95 ℃ 5 s，退火 60 ℃ 34 s，共 40 個循環(huán)；從 65 ℃到95 ℃制作融解曲線。

qPCR所獲得的數(shù)據(jù)，利用2-△Ct（△Ct=目的基因Ct值-GAPDH Ct值）公式進行目的基因在腎組織上相對表達量計算。見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（）表示，當(dāng)滿足正態(tài)性和方差齊時采用單因素方差分析，當(dāng)不滿足時用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 qPCR中的引物序列及擴增片段大小

2 結(jié)果

2.1 各組一般觀察

實驗期間，瞿麥高劑量組和中劑量組的小鼠在腹腔注射后7 min左右出現(xiàn)明顯的腹部抽搐、蜷縮的癥狀，低劑量組有輕微的腹部抽搐的癥狀。高、中劑量組飲食飲水均下降，被毛缺乏光澤。在整個實驗過程中，高劑量組死亡小鼠共計6只，中劑量組4只。

2.2 各組肝、腎臟血生化檢測

瞿麥高劑量組升高了小鼠尿酸（uric acid，UA）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的含量；瞿麥低劑量組升高乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的含量。見圖1。

圖1 瞿麥對小鼠血生化的影響[瞿麥腎臟血生化檢測（A），瞿麥肝臟血生化檢測（B）]

2.3 各組肝、腎、肺、脾臟指數(shù)

瞿麥高、中劑量可顯著增加小鼠腎臟及肺臟指數(shù)；瞿麥低劑量能顯著增加小鼠脾臟指數(shù)。見圖2。

圖2 瞿麥對小鼠臟器指數(shù)的影響[瞿麥腎臟指數(shù)（A），瞿麥肝臟指數(shù)（B），瞿麥肺臟指數(shù)（C），瞿麥脾臟指數(shù)（D）]

2.4 各組肝、腎、肺、脾組織病理結(jié)果

隨著劑量的增加，肝臟組織邊緣區(qū)域逐漸出現(xiàn)凝固性壞死，壞死肝細胞周圍肝細胞氣球樣變，細胞核固縮，炎癥細胞浸潤。見圖3。

隨著劑量的增加，腎組織被膜逐漸增厚，被膜內(nèi)疏松結(jié)締組織增長，炎癥細胞浸潤；腎皮質(zhì)內(nèi)管腔逐漸狹窄，管腔不規(guī)則；皮質(zhì)內(nèi)小管的上皮細胞體積增大，胞漿疏松，淡染，內(nèi)有空泡，且癥狀隨著劑量的增加而加重，胞質(zhì)流失，細胞壞死細胞核也逐漸消失。說明藥物對小鼠的腎組織有所損傷。見圖4。

隨著劑量的增加，肺臟組織出現(xiàn)肺泡內(nèi)偶見蛋白滲出，肺泡壁炎癥細胞浸潤。見圖5。

隨著劑量的增加，脾臟組織被膜下，淋巴細胞減少，生發(fā)中心體積變小，邊緣區(qū)細胞丟失。見圖6。

圖3 瞿麥對小鼠肝臟組織的病理學(xué)檢測結(jié)果

圖4 瞿麥對小鼠腎臟組織的病理學(xué)檢測結(jié)果

圖5 瞿麥對小鼠肺臟組織的病理學(xué)檢測結(jié)果

圖6 瞿麥對小鼠脾臟組織的病理學(xué)檢測結(jié)果

2.5 腎臟損傷基因檢測

與空白組比較，瞿麥高劑量組能夠極顯著抑制OAT1和OAT3 mRNA的表達；瞿麥中、低劑量組可以顯著抑制OAT1和OAT3 mRNA的表達。

圖6 麥對小鼠腎臟中有機陰離子轉(zhuǎn)運體OAT1和OAT3 mRNA的影響[瞿麥對小鼠腎臟中有機陰離子轉(zhuǎn)運體OAT1 mRNA的影響（A），瞿麥對小鼠腎臟中有機陰離子轉(zhuǎn)運體OAT3 mRNA的影響（B）]

3 討論

本研究采用不同劑量的瞿麥水煎劑，通過肝、腎功能的血生化檢測，臟器指數(shù)分析，組織病理學(xué)檢測小鼠主要臟器組織形態(tài)變化；利用qPCR檢測了有機陰離子轉(zhuǎn)運體OAT1和OAT3在瞿麥引起小鼠毒性損傷中的作用。結(jié)果顯示，瞿麥中、高劑量組對小鼠各主要臟器均有不同程度的損傷，且腎臟尤為嚴(yán)重。因此，本研究探索瞿麥對小鼠腎臟損傷的分子機制，發(fā)現(xiàn)瞿麥各劑量組可不同程度的抑制有機陰離子轉(zhuǎn)運體mRNA的表達。

研究表明，瞿麥水煎劑會導(dǎo)致妊娠期小鼠在早、中期出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎[3]。但是，瞿麥?zhǔn)欠駥δI臟、肝臟等主要臟器造成毒性還鮮有報道。目前，用于檢測腎、肝臟損害的毒性作用最常用的是血液生化檢測，尿肌酐和血尿素氮的濃度取決于腎排泄能力，可以在一定程度上反映腎小球濾過功能的損害程度，而ALP、ALT和AST是主要反映肝功能受損的指標(biāo)。但血液生化檢測靈敏度較低，通常是在腎、肝臟組織已出現(xiàn)中度以上的明顯損傷后才升高[16]。本研究結(jié)果也顯示，瞿麥高劑量組升高了小鼠UA和BUN的含量，瞿麥低劑量組升高了LDH、ALP、AST的含量，但結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。病理結(jié)果表明，瞿麥對肝臟、腎臟已經(jīng)有了明顯的損害，且腎臟病理學(xué)改變更嚴(yán)重。藥物對臟器系數(shù)的影響可以作為動物臟器損傷的初步指標(biāo)。隨著瞿麥劑量的增加，腎臟系數(shù)也逐漸增加。因此，推斷腎臟是瞿麥產(chǎn)生毒性作用的主要靶器官。

腎臟的結(jié)構(gòu)及生理功能使其易受藥物毒性成分的損害。腎臟損害主要表現(xiàn)為腎小球、腎小管損傷、導(dǎo)致腎缺血、間質(zhì)性腎炎等。蒙藥對腎臟可能造成的損害不容忽視，而瞿麥在體內(nèi)排泄的過程中是否對腎臟有所損傷，尚無相關(guān)研究報道。且在臨床上常用復(fù)方瞿麥治療慢性腎炎，糖尿病腎病等腎臟疾病。那瞿麥在何種劑量之下可以對腎臟有保護作用，在何種劑量下對腎臟有毒性作用？本研究使用的瞿麥低劑量為0.25 g/ml，相當(dāng)于成人臨床劑量的5倍，已經(jīng)造成腎臟的輕度損傷。盡管臨床上不會用到實驗劑量，但長期服用也許會通過積累導(dǎo)致腎臟的慢性損害。所以要注意嚴(yán)格控制臨床長期使用瞿麥的劑量。因此，研究瞿麥?zhǔn)欠駮斐赡I臟的損傷，具有重要的臨床及理論研究意義。

OAT家族中的OAT1多表達在腎近曲小管上皮細胞基底膜側(cè)[17]；OAT3在腎近曲小管和腎小管各部位基底膜側(cè)都有表達。眾多內(nèi)、外源性有機陰離子型化合物在腎小管處的分泌和重吸收，均是由它們介導(dǎo)的；是幫助哺乳動物排泄體內(nèi)毒性物質(zhì)的重要轉(zhuǎn)運體[18]，其對藥物的代謝作用有不可替代的位置[19]。而OAT1和OAT3在腎臟中表達的下調(diào)，可能導(dǎo)致腎臟產(chǎn)生炎癥，從而減少腎臟對毒性物質(zhì)的分泌排泄和增加有機陰離子的積累[20-21]。本實驗中通過 mRNA分子水平的檢驗證實了瞿麥（0.25、0.50、2.50 g/ml）給藥7 d后，產(chǎn)生腎臟毒性損害時，OAT1和OAT3在腎臟組織內(nèi)的表達量降低，腎臟病理切片結(jié)果也顯示腎臟出現(xiàn)大面積的炎癥浸潤；可見瞿麥有抑制腎小管上OAT的作用，直接導(dǎo)致腎臟毒性物質(zhì)的積累，可能是瞿麥導(dǎo)致腎臟毒性作用的主要機制之一。

因此，為了確保民族醫(yī)藥的用藥安全，為患者的健康提供保障，迫切需要對中藥、蒙藥進行毒理研究，從而為尋找靶器官，解決蒙藥腎、肝等主要臟器損害的途徑和方法提供科學(xué)依據(jù)。