楊麗霞 曽希珂 易 姿

(長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長(zhǎng)沙 410036)

四環(huán)素類抗生素(tetracyclines，TCs)是一類重要的抗生素，因其具有抗菌譜廣、藥性穩(wěn)定、低毒、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在治療革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌引起的人畜感染中得到了廣泛的應(yīng)用[1-2]。目前，四環(huán)素在家畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖中常被使用[3-4]，導(dǎo)致日常食品中存在四環(huán)素殘留，特別多見(jiàn)于肉類、魚(yú)、牛奶和蜂蜜等動(dòng)物產(chǎn)品中[5-7]。人通過(guò)食物長(zhǎng)期低劑量攝入四環(huán)素并在體內(nèi)蓄積，易引起人體內(nèi)耐藥菌株的產(chǎn)生和增加，導(dǎo)致胃腸道疾病、過(guò)敏、腎毒性，以及血液或中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病[8]。因此，應(yīng)該控制四環(huán)素等抗生素的使用，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[9]規(guī)定雞蛋中四環(huán)素殘留限量應(yīng)≤400 μg/kg，肌肉中≤200 μg/kg，肝臟中≤600 μg/kg，牛奶中≤100 μg/kg。其他國(guó)家也制定了動(dòng)物產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。例如，歐盟[10]規(guī)定，雞蛋中四環(huán)素殘留的最大限量應(yīng)≤200 μg/kg，肌肉中≤100 μg/kg，肝臟中≤300 μg/kg，牛奶中≤100 μg/kg。

目前，四環(huán)素的檢測(cè)已成功建立了多種分析方法，包括高效液相色譜法[11]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[12]、微生物分析法[13]、毛細(xì)管電泳法[14-15]、酶免疫分析[16]以及電化學(xué)免疫傳感器[17-19]等。盡管其中一些方法[11-12]具有較高的選擇性和足夠的靈敏度，但大多數(shù)方法都或多或少地存在一些缺點(diǎn)，如儀器相對(duì)昂貴、樣品制備過(guò)程復(fù)雜、預(yù)處理耗時(shí)等。

熒光金屬納米分析方法具有操作簡(jiǎn)單、速度快、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)引起了研究人員的廣泛關(guān)注。銅納米簇作為一種新型的功能性納米顆粒，由于合成簡(jiǎn)單、光穩(wěn)定性好以及在水溶液中具有良好的分散性，使其作為熒光探針在生物傳感領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，基于雙鏈DNA和單鏈DNA模板合成的銅納米簇的報(bào)道很多。例如，Wang等[20]基于聚T模板合成銅納米簇，建立了一種曲酸的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)方法。Ou等[21]以聚T為模板的銅納米粒子作為熒光探針靈敏測(cè)定胰蛋白酶。Song等[22]利用雙鏈DNA模板合成銅納米離子，結(jié)合核酸外切酶催化的目標(biāo)循環(huán)擴(kuò)增能力，建立了一種檢測(cè)赭曲霉毒素A的熒光方法。Zhang等[23]運(yùn)用雙鏈DNA模板銅納米粒子作為熒光指示劑，建立了一種無(wú)標(biāo)記熒光方法檢測(cè)多核苷酸激酶活性。Hu等[24]基于雙鏈DNA模板合成銅納米粒子，用于核酸酶的檢測(cè)。Song等[25]利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和雙鏈DNA模板合成的銅納米粒子，建立了一種無(wú)標(biāo)記、非酶促擴(kuò)增的DNA檢測(cè)方法。據(jù)以上文獻(xiàn)報(bào)道，以聚T為模板合成的銅納米簇，具有熒光強(qiáng)度高的特點(diǎn)，尺寸和熒光強(qiáng)度可以通過(guò)聚T單鏈DNA的長(zhǎng)度來(lái)調(diào)節(jié)；另外，相比dsDNA-銅納米簇的合成，為了保證dsDNA模板的有效雜交，通常需要耗時(shí)1 h以上，而聚T銅納米簇的合成只需要幾分鐘即可完成。

在上述基礎(chǔ)上，試驗(yàn)擬以聚T模板合成的銅納米簇作為熒光探針，構(gòu)建一種新的熒光生物傳感方法用于檢測(cè)實(shí)際樣品中的四環(huán)素類抗生素，以期為食品中四環(huán)素類抗生素的快速檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

含30個(gè)堿基的聚胸腺嘧啶寡聚核苷酸鏈(T30)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素、鹽酸金霉素、青霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、鹽酸林可霉素、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素：USP級(jí)，生工生物工程(上海)股份有限公司；

CuSO4·5H2O、抗壞血酸、甘氨酸、精氨酸、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、氯化鈣、氯化鎂：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)：分子生物學(xué)級(jí)，BBI生命科學(xué)有限公司；

緩沖體系：20 mmol/L 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)緩沖溶液(pH=7.5)；

試驗(yàn)用水：超純水(電阻率>18.2 MΩ·cm)，超純水系統(tǒng)SMARTPLUS-N；

熒光分光光度計(jì)：LS-55型，珀金埃爾默股份有限公司；

電子天平：ME204型，瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 熒光銅納米簇的制備

熒光銅納米簇的合成是以T30-DNA鏈為模板在文獻(xiàn)[26]的合成方法上稍作修改。將5 mmol/L抗壞血酸溶液10 μL加入到70 μL含有2 μmol/L T30-DNA的MOPs緩沖溶液(20 mmol/L MOPS，300 mmol/L NaCl，pH=7.5)中混合均勻，再加入10 μL 300 μmol/L CuSO4溶液，室溫下避光孵育5 min，得到熒光銅納米簇。

1.3 檢測(cè)條件的優(yōu)化

由于Cu2+濃度、抗壞血酸濃度、銅納米簇合成時(shí)間、加入四環(huán)素的孵育時(shí)間是影響四環(huán)素檢測(cè)的重要參數(shù)，采用單一變量的原則，對(duì)4個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.1 Cu2+濃度的優(yōu)化 在T30-DNA濃度2 μmol/L，抗壞血酸濃度5 mmol/L，銅納米簇合成時(shí)間5 min，考察Cu2+濃度(100，200，300，400，500，600 μmol/L)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。

1.3.2 抗壞血酸濃度的優(yōu)化 在T30-DNA濃度2 μmol/L，Cu2+濃度300 μmol/L，銅納米簇合成時(shí)間5 min，考察抗壞血酸濃度(1，2，3，4，5，6，7 mmol/L)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。

1.3.3 銅納米簇合成時(shí)間的優(yōu)化 在T30-DNA濃度2 μmol/L，Cu2+濃度300 μmol/L，抗壞血酸濃度5 mmol/L，考察銅納米簇合成時(shí)間(1，2，3，4，5，6，7，8 min)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。

1.3.4 加入四環(huán)素的孵育時(shí)間的優(yōu)化 在T30-DNA濃度2 μmol/L，Cu2+濃度300 μmol/L，抗壞血酸濃度5 mmol/L，銅納米簇合成時(shí)間5 min，考察加入四環(huán)素的孵育時(shí)間(1，2，3，4，5，6，7 min)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。

1.4 四環(huán)素的檢測(cè)

按照1.3的最優(yōu)條件合成熒光銅納米顆粒。將10 μL 不同濃度的四環(huán)素溶液(濃度分別為0.5，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0，150.0，200.0，300.0 μmol/L)與90 μL 熒光銅納米簇溶液混合均勻，保證總體系體積為100 μL，室溫下避光孵育5 min，將溶液移入石英比色皿，使用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光，激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射光譜波長(zhǎng)掃描范圍500～660 nm。

1.5 四環(huán)素檢測(cè)的特異性

為了驗(yàn)證方法的特異性，將濃度為100 μmol/L的鹽酸四環(huán)素(TC)、鹽酸土霉素(OTC)、鹽酸金霉素(AM)、青霉素(PC)、氨芐西林(SAM)、頭孢氨芐(CLX)、鹽酸林可霉素(LM)、鏈霉素(SM)、卡那霉素(KAN)、氯霉素(CM)以及濃度為1 mmol/L的甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、葡萄糖(Glc)、麥芽糖、蔗糖、氯化鈣、氯化鎂等多種目標(biāo)物，按照1.4的步驟加入到熒光銅納米簇溶液中混合均勻，室溫下避光孵育5 min，使用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光。

1.6 牛奶樣品的準(zhǔn)備

純牛奶樣品購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?。吸? g牛奶樣品用5 mL 1%的三氯乙酸超聲提取20 min，然后在15 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液用濾紙過(guò)濾，將收集的濾液用水定容至5 mL，最后將通過(guò)0.22 μm的濾膜后的清液用于樣品分析[27]。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行牛奶樣品中四環(huán)素的分析。

1.7 雞肉樣品的準(zhǔn)備

1.7.1 提取 雞胸肉樣品購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?。樣品中四環(huán)素的提取步驟按照中國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[28]3檢測(cè)方法中的提取步驟進(jìn)行。

1.7.2 凈化 雞肉樣品中四環(huán)素的凈化步驟參考中國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[28]3檢測(cè)方法中的凈化步驟并略有修改。準(zhǔn)確吸取10 mL提取液以1滴/s的速度過(guò)HLB固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶19)淋洗，棄去全部流出液。2.0 kPa以下減壓抽干5 min，最后用10 mL甲醇—乙酸乙酯(V甲醇∶V乙酸乙酯=1∶9)洗脫。將洗脫液氮吹濃縮至干(溫度低于40 ℃)，用1.0 mL超純水溶解殘?jiān)^(guò)0.22 μm 濾膜，收集清液用于樣品分析，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行實(shí)際樣品中四環(huán)素的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法原理

試驗(yàn)方法的檢測(cè)原理如圖1所示。在不添加四環(huán)素的條件下，制備了以T30-ssDNA為模板的銅納米簇，并表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能。T30-ssDNA模板銅納米簇的形成通常包括兩個(gè)步驟：胸腺嘧啶和Cu2+之間的結(jié)合作用，促進(jìn)了“胸腺嘧啶-Cu2+”復(fù)合物的形成；抗壞血酸沿poly-T模板骨架將胸腺嘧啶絡(luò)合的Cu2+還原為Cu0，形成了銅納米簇，在340 nm激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)條件下，具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)傳感體系中存在目標(biāo)物四環(huán)素時(shí)，銅納米簇的熒光強(qiáng)度顯著降低。這可能是由于四環(huán)素與poly-T模板銅納米簇表面的基團(tuán)發(fā)生相互作用，猝滅了銅納米顆粒的熒光，導(dǎo)致熒光信號(hào)的降低。試驗(yàn)通過(guò)研究四環(huán)素存在與否對(duì)熒光響應(yīng)的差異，設(shè)計(jì)了一種無(wú)標(biāo)記、選擇性的四環(huán)素?zé)晒馍飩鞲衅鳌?/p>

2.2 熒光傳感檢測(cè)方法的可行性

為了檢驗(yàn)該熒光傳感方法用于四環(huán)素檢測(cè)的可行性，即四環(huán)素的存在與否對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響，測(cè)定了四環(huán)素存在與不存在時(shí)銅納米簇的熒光值。如圖2所示，當(dāng)銅納米簇體系中加入10 μL超純水時(shí)，檢測(cè)到強(qiáng)熒光值，當(dāng)加入10 μL的300 μmol/L的四環(huán)素時(shí)，熒光值顯著降低。以上結(jié)果表明該熒光傳感檢測(cè)方法用于四環(huán)素的檢測(cè)是可行的。

圖1 基于非標(biāo)記聚T單鏈DNA模板銅納米簇的四環(huán)素傳感檢測(cè)原理

2.3 試驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1 Cu2+濃度的優(yōu)化 根據(jù)檢測(cè)原理，所開(kāi)發(fā)傳感器的檢測(cè)性能在很大程度上取決于銅納米簇的熒光強(qiáng)度。因此，考察了合成條件對(duì)反應(yīng)的影響。如圖3所示，銅納米簇的熒光強(qiáng)度隨Cu2+濃度的增加而迅速升高，當(dāng)Cu2+濃度為300 μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最高，當(dāng)Cu2+濃度>300 μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度隨之降低。這可能是由于較高濃度的Cu2+經(jīng)還原劑活化后，通過(guò)氧基自由基降解聚T模板。結(jié)果表明，Cu2+的最佳濃度為300 μmol/L。

2.3.2 抗壞血酸濃度的優(yōu)化 從圖4可以看出，隨著抗壞血酸濃度的增加，熒光強(qiáng)度顯著增加，當(dāng)抗壞血酸濃度為5 mmol/L時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最高。因此，選擇5 mmol/L為抗壞血酸最佳濃度。

2.3.3 銅納米簇合成時(shí)間優(yōu)化 如圖5所示，當(dāng)T30-ssDNA中加入Cu2+和抗壞血酸后，隨著孵育時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度迅速增加，當(dāng)時(shí)間為5 min時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最高并趨于平穩(wěn)，因此，5 min被選為銅納米簇的最佳合成時(shí)間。

a. 不存在四環(huán)素 b. 存在300 μmol/L四環(huán)素

圖3 Cu2+濃度對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

圖4 抗壞血酸濃度對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

2.3.4 四環(huán)素孵育時(shí)間優(yōu)化 如圖6所示，四環(huán)素加入后，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)熒光強(qiáng)度逐漸降低，孵育時(shí)間超過(guò)5 min后熒光強(qiáng)度趨于平穩(wěn)。在最初的3 min內(nèi)，熒光度迅速下降(下降了89%)。因此，為了獲得較短的反應(yīng)時(shí)間，選擇5 min為四環(huán)素最佳孵育時(shí)間。熒光法對(duì)四環(huán)素的定量分析性能，在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下

2.4 檢測(cè)方法的性能

為了進(jìn)一步研究基于T30-ssDNA模板的銅納米簇檢測(cè)了加入不同濃度四環(huán)素的熒光強(qiáng)度。圖7描繪了在不同濃度的四環(huán)素存在下，T30-ssDNA為模板的銅納米簇的典型熒光光譜。從圖7可以看出，在0～300 μmol/L的四環(huán)素濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨濃度的增加逐漸降低。圖8示出了四環(huán)素濃度與610 nm處的熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系。在0～80 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度和四環(huán)素濃度之間獲得了良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-0.687 9CTC+96.122，線性回歸系數(shù)R2=0.996 1。根據(jù)空白響應(yīng)的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，檢測(cè)限為0.01 μmol/L，按式(1)進(jìn)行換算后可得到：用于四環(huán)素殘留量的檢測(cè)范圍為0～384 720 μg/kg，且測(cè)定低限為48 μg/kg，略低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[28]5檢測(cè)方法(液相色譜質(zhì)譜法)的檢測(cè)限50 μg/kg。根據(jù)中國(guó)現(xiàn)行判定標(biāo)準(zhǔn)[9]的規(guī)定，牛奶樣品中的四環(huán)素殘留限量為100 μg/kg，肌肉樣品中的四環(huán)素殘留限量為200 μg/kg，該標(biāo)準(zhǔn)中四環(huán)素殘留限量均在試驗(yàn)方法四環(huán)素殘留量的檢測(cè)范圍內(nèi)，這些結(jié)果進(jìn)一步證明，試驗(yàn)提出的無(wú)標(biāo)記熒光生物傳感器可以應(yīng)用于目標(biāo)四環(huán)素的定量分析，性能良好，且該方法能對(duì)實(shí)際樣品四環(huán)素殘留量是否合格進(jìn)行判定。

圖5 銅納米簇合成時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

圖6 四環(huán)素孵育時(shí)間對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

熒光曲線從上至下四環(huán)素濃度分別是0.0，0.5，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0，150.0，200.0，300.0 μmol/L

圖8 濃度校準(zhǔn)曲線

(1)

式中：

X——樣品中待測(cè)組分的含量，μg/kg；

c——測(cè)定液中待測(cè)組分的濃度，μmol/L；

v——測(cè)定液的體積，0.1 mL；

m——待測(cè)樣品的質(zhì)量，g；

500——稀釋倍數(shù)；

480.9——四環(huán)素的摩爾分子量。

2.5 檢測(cè)方法的特異性

為了驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性，測(cè)試了其他抗生素、金屬離子、氨基酸、糖類等對(duì)銅納米簇的熒光影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知，只有四環(huán)素類抗生素(鹽酸四環(huán)素、土霉素、金霉素)能顯著降低銅納米簇的熒光強(qiáng)度，其他干擾物對(duì)熒光強(qiáng)度無(wú)影響，以上結(jié)果表明四環(huán)素類抗生素對(duì)銅納米簇的熒光猝滅作用具有特異性。

2.6 實(shí)際樣品分析

為探討食品中四環(huán)素測(cè)定方法的可行性，分別在牛奶和雞肉樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法評(píng)價(jià)了該方法的實(shí)用性。結(jié)果見(jiàn)表1。牛奶樣品中，3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率在98.72%～108.30%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為2.36%～4.01%，雞肉樣品中，3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率在97.67%～110.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為2.98%～3.84%，表明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確性較好，能夠被用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

3 結(jié)論

利用聚T單鏈為模板制備銅納米簇作為熒光探針構(gòu)建了一種熒光生物傳感方法用于四環(huán)素的檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法對(duì)四環(huán)素具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)的檢測(cè)能力，檢測(cè)限為0.01 μmol/L。與其他方法相比，該檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：① 這種新型傳感器無(wú)需共軛或標(biāo)記過(guò)程，所有的反應(yīng)過(guò)程都在10 min內(nèi)室溫避光下完成；② 對(duì)四環(huán)素類抗生素具有較高的特異性。此外該方法可用于牛奶、雞肉等實(shí)際樣品中四環(huán)素的測(cè)定，因此作為一種無(wú)標(biāo)記、快速、高選擇性、高靈敏度的四環(huán)素類的檢測(cè)平臺(tái)，在食品分析等領(lǐng)域的小分子檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。