王 鑫，許曉東

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

桿狀病毒(baculoviruses)是一類具有囊膜包被的DNA病毒，編碼90～180個(gè)基因，是目前研究發(fā)現(xiàn)的最大一類節(jié)肢動(dòng)物特異性病毒[1]。同其他大型DNA病毒一樣，桿狀病毒基因表達(dá)也具有時(shí)序性[2]。根據(jù)表達(dá)時(shí)間的先后，將桿狀病毒基因分為早期基因、晚期基因和極晚期基因3種。其中早期基因表達(dá)依賴于宿主的RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，晚期基因表達(dá)依賴于桿狀病毒自身編碼的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄[3]。

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是桿狀病毒的模式種，編碼154個(gè)基因。20世紀(jì)90年代，科學(xué)家通過瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)鑒定出能夠參與AcMNPV晚期表達(dá)調(diào)控的基因。到目前為止，已經(jīng)鑒定出19個(gè)晚期表達(dá)因子(late expression factor，LEF)[4-5]。其中，LEF-1[6]、LEF-2[7]、LEF-3[8-9]、lef-7[10]、LEF-11[11]、IE1[12]、ie2[13]、p35[14]、P143[8]、dnapol[14]與DNA復(fù)制相關(guān)，lef-4[15]、LEF-5[16]、LEF-6[17]、lef-8[15]、lef-9[15]、LEF-10[18]、lef-12[19]、p47[15]和pp31[20]與晚期基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)。

所有Group Ⅰ組和大部分Group Ⅱ的nuclear polyhedroviruses(NPVs)和granulosis viruses(GVs)基因組中均鑒定出LEF-10的同源基因[5]。AcMNPV編碼的LEF-10由78個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為8.6 ku。在AcMNPV bacmid和家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclear polyhydrosis virus，BmNPV) bacmid中，敲除lef-10基因后病毒無法存活[21-22]，表明lef-10是病毒復(fù)制的必需基因。研究發(fā)現(xiàn)LEF-10具有朊病毒特性，其保守的第21位氨基酸殘基突變成丙氨酸殘基時(shí)能降低LEF-10蛋白的聚集傾向，并最終影響晚期報(bào)告基因的表達(dá)[23]。即以高感染復(fù)數(shù)(MOI)感染宿主細(xì)胞時(shí)，晚期報(bào)告基因的表達(dá)效率大大提高。

研究發(fā)現(xiàn)，LEF-10蛋白的氨基末端是必需的[24]，而其第21位氨基酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢鶗r(shí)影響LEF-10蛋白的聚集狀態(tài)[23]。為了探究LEF-10第21位不同氨基酸殘基對AcMNPV活性的影響，本研究對該位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，并通過異位回補(bǔ)和原位突變兩種方式構(gòu)建重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，檢測重組病毒的活性，為深入研究LEF-10的朊病毒特性及其在病毒復(fù)制周期中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞系 大腸桿菌HS996(EscherichiacoliHS996)(含有AcMNPV bacmid和pSC101重組酶質(zhì)粒)，由英國雷丁大學(xué)(University of Reading)Prof. Ian Jones實(shí)驗(yàn)室饋贈；pTriEx-p(lef-10)-LEF-10-GFP-p(p10)-dsRed質(zhì)粒、BacmidΔlef-10、prpsL-AMP質(zhì)粒、pTriEx-p(p10)-dsRed質(zhì)粒、大腸桿菌Top10(EscherichiacoliTop10)和草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞系，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，購于上海生工生物工程有限公司；2×EsTaqMaster Mix，購于康維世紀(jì)公司；T4 DNA連接酶、BamH Ⅰ、PshA Ⅰ、Bsu36 Ⅰ、RNaseA酶，購于美國紐英倫生物技術(shù)公司(NEB)；DL5000 DNA Marker，購于北京擎科生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉，購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉、DNA抽提試劑(體積比苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1,pH>7.8)，購于北京索萊寶科技有限公司；L-阿拉伯糖，購于Wolsen公司；SFX-INSECT培養(yǎng)基、胎牛血清，購于Thermo Fisher公司；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑，購于Promega公司。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 本試驗(yàn)所用引物(表1)均用SnapGene軟件設(shè)計(jì)，由蘇州金維智生物科技有限公司和北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 研究所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

表1(續(xù)) Continued table 1

1.2 構(gòu)建異位回補(bǔ)lef-10L21X的重組病毒(X代表19種不同的氨基酸殘基)

為了檢測LEF-10第21位對AcMNPV活性的影響，本試驗(yàn)將pTriEx-p(lef-10)-LEF-10-GFP-p(p10)-dsRed質(zhì)粒上LEF-10的第21位亮氨酸殘基飽和突變?yōu)槠渌?9種氨基酸殘基，再與敲除了lef-10的Bacmid(BacmidΔlef-10)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，得到重組病毒lef-10L21XBacmid，檢測第21位上不同氨基酸殘基能否回補(bǔ)缺陷的BacmidΔlef-10。

1.2.1 19種lef-10L21X片段的PCR擴(kuò)增 LEF-10第21位的點(diǎn)突變通過PCR引物引入。以pTriEx-p(lef-10)-LEF-10-GFP-p(p10)-dsRed質(zhì)粒為模板，分別用上游引物(PshAI_G、PshAI_I、PshAI_P、PshAI_V、PshAI_F、PshAI_W、PshAI_Y、PshAI_D、PshAI_E、PshAI_R、PshAI_H、PshAI_K、PshAI_S、PshAI_T、PshAI_C、PshAI_M、PshAI_N、PshAI_Q、PshAI_A)和下游引物(BamHI-lef10-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：2×EsTaqMaster Mix 10 μL，10 μmol/L的上游引物1 μL，10 μmol/L的下游引物1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段，將回收后的PCR產(chǎn)物置于-20 ℃保存。

1.2.2 pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed質(zhì)粒的構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶PshA Ⅰ、BamH Ⅰ對1.2.1節(jié)中回收的PCR產(chǎn)物和pTriEx-p(lef-10)-LEF-10-GFP-p(p10)-dsRed質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收。使用T4 DNA連接酶將適宜濃度的片段與載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10感受態(tài)并進(jìn)行復(fù)蘇。復(fù)蘇完成后，將細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素(終質(zhì)量濃度為50 μg/mL)的平板，倒置,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。因點(diǎn)突變不會改變基因片段的大小，故無法通過雙酶切驗(yàn)證。使用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，將提取好的質(zhì)粒送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定，構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed。

1.2.3 異位回補(bǔ)重組病毒的構(gòu)建 將構(gòu)建好的pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed質(zhì)粒與線性化的BacmidΔlef-10共轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞，獲得重組病毒。轉(zhuǎn)染步驟為：將Sf9細(xì)胞鋪入12孔板中，細(xì)胞匯合度約為70%。分別向兩個(gè)無菌的1.5 mL離心管加入70 μL ddH2O，再向其中一管中加入5 μL的轉(zhuǎn)染試劑，向另一管中加入5 μL線性化BacmidΔlef-10和2 μL pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed質(zhì)粒。將兩管分別混勻后，再將前管混合物加入后管再次混勻，室溫靜置15～20 min后逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，28 ℃靜置培養(yǎng)5～7 d。使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照，收集病毒上清，傳代2次，得到P2代重組病毒，于-4 ℃保存。

1.3 原位突變lef-10L21X重組病毒的構(gòu)建

為避免異位回補(bǔ)產(chǎn)生位置效應(yīng)，本試驗(yàn)直接在Bacmid上進(jìn)行原位突變，構(gòu)建重組病毒(Bacmidlef-10L21X)，檢測LEF-10第21位氨基酸殘基對AcMNPV活性的影響。

1.3.1 含lef-10兩側(cè)同源臂的rpsL-AMP DNA片段的PCR擴(kuò)增 以prpsL-AMP質(zhì)粒為模板，用上游引物Bac-lef10-F和下游引物Bac-lef10-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件同1.2.1節(jié)(延伸時(shí)間改為60 s)。用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段，置于-20 ℃保存。

1.3.2 AcMNPV中l(wèi)ef-10基因的敲除 將-80 ℃凍存的大腸桿菌HS996(含有AcMNPV bacmid和pSC101重組質(zhì)粒)菌液在含有四環(huán)素(3 μg/mL)和卡那霉素(15 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，30 ℃避光過夜培養(yǎng)。挑取單克隆至含四環(huán)素(3 μg/mL)和卡那霉素(15 μg/mL)的5 mL LB液體培養(yǎng)基，于30 ℃、250 r/min避光過夜培養(yǎng)。以體積比1∶100將菌液轉(zhuǎn)接到含卡那霉素和四環(huán)素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min避光培養(yǎng)至OD600值為0.2～0.3時(shí)，向離心管中加入50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)重組酶，繼續(xù)于37 ℃、250 r/min避光培養(yǎng)45 min。根據(jù)Counter-Selection BAC Modification Kit手冊制備EscherichiacoliHS996感受態(tài)[25]。吸取1 μL 1.3.1節(jié)中所得PCR片段與E.coliHS996感受態(tài)混勻后，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，電壓設(shè)置為1 300 V。電擊后向電轉(zhuǎn)杯中加入1 mL LB液體培養(yǎng)基重懸菌液進(jìn)行復(fù)蘇，于37 ℃、220 r/min避光培養(yǎng)60 min。最后涂布于含有氨芐青霉素(50 μg/mL)、卡那霉素(15 μg/mL)和四環(huán)素(3 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，倒置,于30 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)36～48 h。

1.3.3 敲除lef-10基因菌落的篩選 挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR篩選。以UT-LEF10和1stUT作為篩選引物。PCR反應(yīng)體系與條件同1.2.1節(jié)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性菌落接種于5 mL含氨芐青霉素(50 μg/mL)、卡那霉素(15 μg/mL)和四環(huán)素(3 μg/mL)的液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min避光過夜培養(yǎng)，將菌液在終體積分?jǐn)?shù)為25%的甘油中，于-80 ℃保存。

1.3.4 含有同源臂lef-10L21X片段的PCR擴(kuò)增 以不同的pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed質(zhì)粒為模板，用上游引物FS-L21-F和下游引物FS-L21-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系與條件同1.2.1節(jié)。用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段，于-20 ℃保存。

1.3.5 將lef-10L21X片段反篩回AcMNPV 將1.3.3 節(jié)中得到的陽性菌落與1.3.4節(jié)中得到的lef-10L21X片段進(jìn)行同源重組，搖菌時(shí)使用含有氨芐青霉素(50 μg/mL)、卡那霉素(15 μg/mL)和四環(huán)素(3 μg/mL)的液體培養(yǎng)基，最后涂布于含有卡那霉素(15 μg/mL)、四環(huán)素(3 μg/mL)和鏈霉素(50 μg/mL)的平板上，其他步驟同1.3.2節(jié)。

1.3.6 反篩lef-10L21XAcMNPV的篩選 挑取菌苔上的單克隆進(jìn)行菌落PCR篩選。以PshAI-G和BamHⅠ-lef10-R作為篩選引物。PCR反應(yīng)體系與條件同1.2.1節(jié)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將PCR產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，以確定插入片段的序列。將測序正確的陽性菌落接種于5 mL含卡那霉素(15 μg/mL)、四環(huán)素(3 μg/mL)和鏈霉素(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min避光過夜培養(yǎng)，將菌液在終體積分?jǐn)?shù)為25%的甘油中，于-80 ℃保存。

1.3.7 原位突變重組病毒的構(gòu)建 提取20種Bacmidlef-10L21X桿粒，用Bsu36 Ⅰ酶切線性化并用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，分別與pTriEx-p(p10)-dsRed質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟同1.2.3節(jié)。傳代2次，得到P2代重組病毒，于4 ℃保存。

1.4 病毒滴度測定

采用極限稀釋法[26]測定重組病毒的滴度。將Sf9細(xì)胞鋪入96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)基。將1.3.7節(jié)中的重組病毒依次10倍稀釋至10-9稀釋度。將10 μL重組病毒稀釋液加入96孔板中，每種病毒3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。28 ℃培養(yǎng)7 d，通過熒光顯微鏡觀察96孔板中細(xì)胞產(chǎn)生熒光孔的數(shù)目，并根據(jù)Reed-Muench兩氏法計(jì)算病毒的滴度TCID50。

1.5 重組病毒對外源蛋白表達(dá)影響的檢測

將Sf9細(xì)胞鋪入12孔板，將1.3.7節(jié)中的重組病毒P2分別以MOI=1和MOI=10感染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞，28 ℃培養(yǎng)3 d后收集細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測dsRed熒光蛋白的表達(dá)情況，并用NovoExpress軟件分析數(shù)據(jù)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 lef-10L21X Bacmid轉(zhuǎn)染和感染Sf9細(xì)胞

將構(gòu)建好的pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed質(zhì)粒與線性化的BacmidΔlef-10共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，通過同源重組產(chǎn)生重組病毒。其中綠色熒光蛋白(GFP)由lef-10啟動(dòng)子啟動(dòng)(信號弱)，紅色熒光蛋白(dsRed)由p10啟動(dòng)子啟動(dòng)(信號強(qiáng)),故本試驗(yàn)利用紅色熒光蛋白的表達(dá)及病毒能否傳代,檢測判斷LEF-10第21位上突變的不同氨基酸殘基對AcMNPV活性的影響,結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，lef-10 Bacmid、lef-10L21IBacmid、lef-10L21ABacmid、lef-10L21FBacmid、lef-10L21CBacmid、lef-10L21MBacmid、lef-10L21VBacmid 7種異位突變型重組病毒出現(xiàn)二次感染。

圖1 20種異位回補(bǔ)重組病毒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞熒光顯微觀察Fig.1 Fluorescence microscopic observation of Sf9 cells transfected by 20 ectopic backfilling recombinant viruses

用20種重組病毒感染Sf9細(xì)胞時(shí)，與預(yù)期一致，只有上述7種重組病毒產(chǎn)生熒光信號，即成功感染Sf9細(xì)胞(圖2)。

圖2 異位回補(bǔ)重組病毒感染Sf9細(xì)胞熒光顯微觀察Fig.2 Fluorescence microscopic observation of Sf9 cells infected by ectopic backfilling recombinant viruses

2.2 rpsL-AMP DNA片段的擴(kuò)增

以prpsL-AMP質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增含有l(wèi)ef-10基因兩側(cè)同源臂的rpsL-AMP DNA片段，得到1 493 bp的特異性片段(圖3)，與預(yù)期結(jié)果一致。

M.DNA Marker；1.rpsL-AMP DNA片段M.DNA Marker;1.rpsL-AMP DNA fragment圖3 rpsL-AMP DNA片段的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of rpsL-AMP DNA fragment

2.3 敲除lef-10基因的AcMNPV陽性菌落鑒定

通過菌落PCR篩選在氨芐青霉素抗性平板上的陽性菌落，引物設(shè)計(jì)原則為2條引物分別結(jié)合敲除位點(diǎn)的上游/下游和插入基因，因此如無擴(kuò)增條帶則說明敲除失敗，如擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶則說明敲除成功。PCR擴(kuò)增得到的DNA片段大小為328 bp(圖4)，與預(yù)期相符，證明篩選結(jié)果為陽性的菌落中，lef-10基因已被rpsL-AMP DNA片段成功替換。

M.DNA Marker；1～2.敲除lef-10基因的陽性菌落M.DNA Marker;1-2.Positive colonyof knock-out lef-10 gene圖4 敲除lef-10基因的陽性菌落PCR鑒定Fig.4 Identification of positive colonies knock-out lef-10 gene by PCR

2.4 反篩AcMNPV lef-10L21X陽性菌落的鑒定

通過菌落PCR篩選在鏈霉素抗性平板中的陽性菌落。引物設(shè)計(jì)原則同2.3節(jié)。PCR擴(kuò)增的DNA片段大小為216 bp,符合預(yù)期大小(圖5)，且PCR產(chǎn)物測序結(jié)果也符合預(yù)期，表明rpsL-AMP DNA片段成功被lef-10L21X片段替換。

M.DNA Marker；1～19.依次為lef-10L21G、lef-10L21I、lef-10L21P、lef-10L21V、lef-10L21F、lef-10L21W、lef-10L21Y、lef-10L21D、lef-10L21E、lef-10L21R、lef-10L21H、lef-10L21K、lef-10L21S、lef-10L21T、lef-10L21C、lef-10L21M、lef-10L21N、lef-10L21Q、lef-10L21A的陽性菌落M.DNA Marker;1-19.In order of lef-10L21G,lef-10L21I,lef-10L21P,lef-10L21V,lef-10L21F,lef-10L21W,lef-10L21Y,lef-10L21D,lef-10L21E,lef-10L21R,lef-10L21H,lef-10L21K,lef-10L21S,lef-10L21T,lef-10L21C,lef-10L21M,lef-10L21N,lef-10L21Q,lef-10L21A positive colony,respectively圖5 lef-10L21X反篩陽性菌落的PCR鑒定Fig.5 Identification of lef-10L21X reverse sieving positive colony

2.5 Bacmid lef-10L21X重組病毒的檢測

將Bacmidlef-10L21X與pTriEx-p(p10)-dsRed質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，通過同源重組產(chǎn)生重組桿狀病毒，利用紅色熒光蛋白(dsRed)的表達(dá)和病毒能否傳代來判斷LEF-10第21位不同氨基酸殘基原位突變是否會影響AcMNPV的活性。從圖6和圖7可以看出，Bacmidlef-10、Bacmidlef-10L21I、Bacmidlef-10L21A、Bacmidlef-10L21F、Bacmidlef-10L21C、Bacmidlef-10L21M、Bacmidlef-10L21V7種原位突變型重組病毒能產(chǎn)生有感染活性的子代病毒。這與2.1節(jié)中異位突變型重組病毒的結(jié)果一致，說明當(dāng)LEF-10第21位突變?yōu)槌鲜?種氨基酸殘基外的其他氨基酸殘基時(shí)，無法獲得重組病毒，即為致死突變。同時(shí)說明第21位不同氨基酸殘基對LEF-10活性的影響無位置效應(yīng)。

圖6 20種原位突變重組病毒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞熒光顯微觀察Fig.6 Fluorescence microscopic observation of Sf9 cells transfected by 20 situ mutant recombinant viruses

圖7 原位突變重組病毒感染Sf9細(xì)胞熒光顯微觀察Fig.7 Fluorescence microscopic observation of Sf9 cells infected by situ mutant recombinant viruses

2.6 Bacmid lef-10L21X重組病毒對外源蛋白表達(dá)的影響

利用極限稀釋法測定7種原位突變重組病毒的病毒滴度，結(jié)果如下：

Bacmidlef-10(TCID50)=1.2×108/mL-1；

Bacmidlef-10L21A(TCID50)=8×107/mL-1；

Bacmidlef-10L21F(TCID50)=1.1×108/mL-1；

Bacmidlef-10L21M(TCID50)=8.8×107/mL-1；

Bacmidlef-10L21V(TCID50)=9.7×107/mL-1；

Bacmidlef-10L21C(TCID50)=7×107/mL-1；

Bacmidlef-10L21I(TCID50)=8.4×107/mL-1。

將7種原位突變重組病毒分別以MOI=1和MOI=10感染Sf9細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞儀檢測dsRed熒光蛋白的表達(dá)量，檢測結(jié)果(圖8)表明：將7種重組病毒以低MOI(MOI=1)感染Sf9細(xì)胞時(shí)，晚期基因的表達(dá)量差異較??；將7種重組病毒以高M(jìn)OI(MOI=10)感染Sf9細(xì)胞時(shí)，Bacmidlef-10、Bacmidlef-10L21M、Bacmidlef-10L21V的外源蛋白表達(dá)量明顯低于其他4種重組病毒；其中Bacmidlef-10L21A重組病毒的外源蛋白表達(dá)量維持在較高水平上。上述結(jié)果表明，Bacmidlef-10L21A重組病毒可能在表達(dá)外源蛋白時(shí)具有優(yōu)勢。

A.以MOI=1感染Sf9細(xì)胞；B.以MOI=10感染Sf9細(xì)胞SF9為未感染的Sf9細(xì)胞；L21～L21I分別為7種重組病毒感染的Sf9細(xì)胞A.Infect Sf9 cells with MOI=1;B.Infect Sf9 cells with MOI=10 SF9 is uninfected Sf9 cells;L21-L21I are Sf9 cells infected by 7 recombinant viruses,respectively圖8 Bacmid lef-10L21X重組病毒表達(dá)外源蛋白的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.8 Flow cytometry results of foreign proteins expression of Bacmid lef-10L21X recombinant viruses

3 討 論

作為最小的桿狀病毒晚期表達(dá)因子，LEF-10與桿狀病毒晚期基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[24]。但目前為止對于LEF-10的研究較少，對LEF-10調(diào)節(jié)病毒晚期基因表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。敲除AcMNPV中的lef-10不能獲得重組病毒，這一現(xiàn)象在BmNPV中也同樣存在[18]，這暗示著lef-10是一個(gè)必需基因。已有研究表明，LEF-10是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的由病毒編碼的朊病毒，具有朊病毒特性。當(dāng)LEF-10高表達(dá)時(shí)會誘導(dǎo)自身聚集，這種聚集會導(dǎo)致部分LEF-10功能的喪失，進(jìn)而影響病毒晚期基因的表達(dá)[23]。序列分析表明，LEF-10序列中，47%的氨基酸殘基是疏水性氨基酸殘基，且保守氨基酸殘基多為疏水性氨基酸殘基[24]，這可能與其聚集現(xiàn)象有關(guān)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生聚集時(shí)，其疏水氨基酸會呈現(xiàn)在聚集體表面，加劇蛋白質(zhì)聚集，故改變蛋白質(zhì)的疏水性也許能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的聚集傾向。針對28種LEF-10的同源基因進(jìn)行序列比對后得知，LEF-10第21位的亮氨酸(疏水氨基酸)殘基為完全保守的位點(diǎn)，將其突變?yōu)楸彼?疏水氨基酸)殘基時(shí)，LEF-10的聚集傾向降低，但這只是疏水氨基酸之間的替換，所以對第21位氨基酸殘基進(jìn)行飽和突變將更具說服力。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將LEF-10第21位氨基酸殘基進(jìn)行飽和突變后外源過表達(dá)回補(bǔ)缺陷型病毒時(shí)，大多數(shù)突變體對AcMNPV來說是致死的，只有野生型及突變?yōu)镮、V、F、C、M和A的6種氨基酸殘基能夠獲得有活性的重組病毒。為了避免異位回補(bǔ)引入的位置效應(yīng)，筆者還對lef-10進(jìn)行內(nèi)源原位回補(bǔ)突變，且得到一致的結(jié)論。值得注意的是，7種氨基酸中除半胱氨酸為親水氨基酸外其他均為疏水氨基酸。這個(gè)結(jié)果證實(shí)第21位氨基酸殘基位對LEF-10的功能起著至關(guān)重要的作用，且從活性上講該位點(diǎn)可能需要一個(gè)疏水氨基酸殘基，雖然該位點(diǎn)為半胱氨酸殘基時(shí)也能拯救病毒，但具體機(jī)制尚不清楚。

LEF-10作為晚期表達(dá)因子，能夠調(diào)控其他晚期基因的表達(dá)，因此以LEF-10突變體作為研究對象對LEF-10功能的研究具有重要意義。本研究構(gòu)建原位突變重組病毒后通過p10啟動(dòng)子啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，以此檢測不同LEF-10突變體對晚期基因表達(dá)的影響。當(dāng)將病毒以1 MOI感染Sf9細(xì)胞時(shí)，7種不同氨基酸殘基對晚期基因表達(dá)的影響無顯著差異；當(dāng)將病毒以10 MOI感染Sf9細(xì)胞時(shí)，報(bào)告基因的表達(dá)量均有不同程度下降，但6個(gè)突變型病毒的活性均明顯高于野生型病毒，其中突變成丙氨酸殘基的重組病毒(Bacmidlef-10L21A)報(bào)告基因表達(dá)量仍維持在較高水平，這與之前報(bào)道相符[23]。這可能是因?yàn)楸彼岫虃?cè)鏈降低了蛋白質(zhì)的聚集傾向，進(jìn)而提高了報(bào)告基因的表達(dá)量。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)存在一個(gè)不可忽視的局限，即在一定的MOI范圍內(nèi)，外源蛋白的產(chǎn)量隨著MOI的提高而增加，但當(dāng)MOI提高到一定程度后，外源蛋白的產(chǎn)量反而會隨MOI的提高而下降。LEF-10L21A聚集傾向的降低，很可能是突破高M(jìn)OI下桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)限制的有效方法。通過研究LEF-10第21位點(diǎn)突變對AcMNPV活性的影響，為進(jìn)一步探究LEF-10的朊病毒特性及其在病毒復(fù)制中的作用奠定了基礎(chǔ)，并可為優(yōu)化桿狀病毒表達(dá)載體提供參考。