尚文倩，王 政，何松林,2，賀 丹，董娜琳，郭 英

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河南 鄭州450002；2 河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3 碧源建工有限公司，河南 鄭州450000)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為落葉亞灌木，又名木芍藥、富貴花等，屬芍藥科芍藥屬植物，是我國(guó)的傳統(tǒng)名花，具有較高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。牡丹品種繁多，其花姿雍容端莊、花色鮮艷，有富貴吉祥和繁榮昌盛的寓意，被封為我國(guó)的國(guó)花。牡丹繁殖多以分株和嫁接為主，但其繁殖時(shí)間較長(zhǎng)且繁殖率低，使牡丹種苗工廠化生產(chǎn)受到很大制約[2]。組織培養(yǎng)具有繁殖速度快、系數(shù)高、周期短、可保持母株優(yōu)良性狀等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于植物的快速繁殖中。國(guó)內(nèi)對(duì)牡丹組織培養(yǎng)的研究始于1982年[3]，但牡丹試管苗誘導(dǎo)存在不定根誘導(dǎo)難度增大[4]、生根率低、不定根質(zhì)量較差[5]和移栽成活率低[6]等問題，嚴(yán)重影響牡丹的快速繁殖。

在植物根系發(fā)生的不同階段，其自身通過調(diào)控相關(guān)酶活性及內(nèi)源激素濃度、比例的變化來影響根系發(fā)育，如過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)等酶類及內(nèi)源激素，均與植物不定根的發(fā)生密切相關(guān)[7-8]。其中植物生長(zhǎng)素吲哚乙酸(IAA)作為促進(jìn)不定根發(fā)生的主要激素，其在植物體內(nèi)分布及作用的部位，對(duì)于研究根系發(fā)生具有重要意義。免疫熒光技術(shù)利用抗體抗原特異性結(jié)合，揭示激素在植物組織的分布和作用位點(diǎn)，從而為其在植物體內(nèi)的作用機(jī)理研究提供依據(jù)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已通過此技術(shù)研究了IAA在不同組織的分布對(duì)百合發(fā)芽分化[9]、葡萄葉片高溫脅迫[10]和擬南芥下胚軸不定根生長(zhǎng)[11]的影響。近年來，有關(guān)牡丹酶活性和內(nèi)源激素的研究主要集中在種子休眠和萌發(fā)[12]、芽休眠[13]、開花[14]、體胚發(fā)生[15]等方面，而關(guān)于試管苗生根方面的報(bào)道較少。本試驗(yàn)擬通過研究牡丹試管苗生根過程中莖基部?jī)?nèi)源IAA組織分布及相關(guān)內(nèi)源激素和酶活性的變化，以期為牡丹等難生根植物的發(fā)根機(jī)理研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 牡丹試管苗誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)

選取5～8年生的牡丹品種‘鳳丹白’未萌動(dòng)鱗芽為外植體，2月取材，消毒后接種于MS+WPM(Ca2+)+6-芐基嘌呤(6-BA)0.3 mg/L+3-吲哚丁酸(IBA)0.5 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L (pH=5.8)的固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為：光強(qiáng)40 μmol/(m2·s)，溫度(23±2) ℃，光照時(shí)間12 h/d，誘導(dǎo)40 d即可得到供試試管苗。將誘導(dǎo)后的試管苗接種于MS+WPM(Ca2+)+6-BA 0.3 mg/L+萘乙酸(NAA)0.5 mg/L+PVP 1 g/L+抗壞血酸(Vc)50 mg/L+水解乳蛋白(LH)0.5 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L (pH=5.8)的培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)50 d，選取生長(zhǎng)一致的試管苗作為供試材料。

將增殖后的試管苗轉(zhuǎn)入含有WPM+WPM(Ca2+)+PVP 1 g/L+糖 30 g/L+植物凝膠2 g/L (pH=5.8)的培養(yǎng)基中，并分別添加質(zhì)量濃度為1，2，3，4 mg/L的IAA，以不添加IAA的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理25株苗，培養(yǎng)條件同1.1節(jié)，40 d后統(tǒng)計(jì)生根指標(biāo)。

1.2 生根指標(biāo)的測(cè)算

采用游標(biāo)卡尺測(cè)量每株生根試管苗的最大根長(zhǎng)，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的生根株數(shù)，然后計(jì)算其生根率、平均根數(shù)、平均最大根長(zhǎng)和生根指數(shù)，具體計(jì)算公式為：

生根率=生根株數(shù)/培養(yǎng)株數(shù)×100%；

平均根數(shù)=生根總數(shù)/生根株數(shù)；

平均最大根長(zhǎng)=生根苗最大根長(zhǎng)總和/生根株數(shù)；

生根指數(shù)=平均最大根長(zhǎng)×平均根數(shù)×生根率。

1.3 酶活性的測(cè)定

采用1.1節(jié)中篩選的最適培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，并在接種后0，1，2，3，4，5，6，10，12，15，20和25 d從瓶中取出試管苗，在4 ℃條件下用蒸餾水反復(fù)沖洗莖基部，并用濾紙吸干，取莖基部0.2 g，用于測(cè)定相關(guān)酶活性，重復(fù)3次，以不加IAA的培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管苗為對(duì)照。POD活性參照愈創(chuàng)木酚法[16]測(cè)定，PPO活性參照鄰苯二酚法[17]測(cè)定，IAAO活性參照張志良[18]的方法測(cè)定。

1.4 內(nèi)源激素IAA含量的測(cè)定

在對(duì)最適培養(yǎng)基培養(yǎng)的牡丹試管苗進(jìn)行生根期間細(xì)胞學(xué)觀察的同時(shí)，另取莖基部0.5 g(重復(fù)3次)，用蒸餾水反復(fù)沖洗后用濾紙吸干，液氮迅速冷凍后，置于-80 ℃保存，以不添加IAA的培養(yǎng)基培養(yǎng)的牡丹試管苗為空白對(duì)照。參考Gou等[19]的方法進(jìn)行內(nèi)源激素提取，采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS)進(jìn)行內(nèi)源IAA含量的測(cè)定，觀察其含量變化與熒光強(qiáng)度的變化是否一致。

1.5 牡丹試管苗生根期間莖基部的細(xì)胞學(xué)觀察及IAA的免疫學(xué)定位

采用最適生根培養(yǎng)基培育的牡丹試管苗進(jìn)行生根期間莖基部的細(xì)胞學(xué)觀察，并采用免疫熒光定位觀察生根期間IAA在牡丹試管苗莖基部的分布位置。對(duì)生根培養(yǎng)的試管苗，在接種后0，3，5，10，15，20和25 d取其莖基部，用蒸餾水反復(fù)沖洗后用濾紙吸干，先將其放入固定液(0.01 mol/L磷酸緩沖液，pH=7.4，內(nèi)含2% EDC·HCl)內(nèi)進(jìn)行固定，抽真空后在室溫下放置1 h，然后取出用磷酸鹽沖洗，轉(zhuǎn)入含有4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的磷酸緩沖液中，4 ℃再次固定12 h，最后參考楊捷頻[20]的方法進(jìn)行石蠟包埋，免疫熒光切片參考張煒等[21]的方法。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0和Excel 2016進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均采用鄧肯氏新復(fù)極差法(SSR法)檢測(cè)其差異顯著性，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度IAA對(duì)牡丹試管苗生根的影響

不同質(zhì)量濃度IAA對(duì)牡丹試管苗生根的影響見表1。

表1 不同質(zhì)量濃度IAA對(duì)牡丹試管苗生根的影響Table 1 Effects of IAA at different concentrations on rooting of tree peony in vitro

由表1可知，隨著IAA質(zhì)量濃度的升高，牡丹試管苗的生根率先升高后降低，在IAA質(zhì)量濃度為3 mg/L時(shí)生根率達(dá)到最高(52.00%)，且與其他處理均差異顯著；平均最大根長(zhǎng)則出現(xiàn)在IAA 2 mg/L的處理，達(dá)到14.09 mm，且與對(duì)照差異顯著；平均根數(shù)在各處理間無顯著差異；生根指數(shù)在IAA 3 mg/L時(shí)最高，表明在培養(yǎng)基中添加3 mg/L IAA最利于牡丹試管苗生根，故后續(xù)試驗(yàn)皆采用加入3 mg/L IAA的生根培養(yǎng)基中培育的牡丹試管苗。

圖1為生根培養(yǎng)35 d時(shí)，加入不同質(zhì)量濃度IAA培育的牡丹試管苗生根情況。

A.生根培養(yǎng)0 d；B-F.生根培養(yǎng)35 d，IAA質(zhì)量濃度依次為0,1,2,3,4 mg/LA.Rooting culture on day 0；B-F.Rooting culture on day 35 with concentrations of 0,1,2,3 and 4 mg/L圖1 不同質(zhì)量濃度IAA處理的牡丹試管苗生根情況Fig.1 Rooting of tree peony in vitro with different IAA concentrations

2.2 牡丹試管苗生根期間相關(guān)酶活性的變化

2.2.1 POD活性 牡丹試管苗生根過程中POD活性的變化見圖2。

圖2 牡丹試管苗生根過程中POD活性的變化Fig.2 Changes of POD activities during rooting of tree peony in vitro

由圖2可知，牡丹試管苗在生根期間的POD活性始終處于上下波動(dòng)趨勢(shì)，其中3 mg/L IAA處理的試管苗在培養(yǎng)3 d時(shí)POD活性達(dá)到峰值，為140.16 μg/(g·min)；培養(yǎng)6 d時(shí)活性達(dá)到最低值，為21.67 μg/(g·min)；生根期間POD活性平均值為63.04 μg/(g·min)。對(duì)照(CK)處理POD活性也在培養(yǎng)3 d達(dá)到峰值，為85.45 μg/(g·min)，但顯著低于3 mg/L IAA處理；培養(yǎng)15 d時(shí)POD活性達(dá)到最低值，為28.33 μg/(g·min)；生根期間POD活性平均值為52.33 μg/(g·min)，顯著低于3 mg/L IAA處理。說明添加IAA能促進(jìn)牡丹試管苗根原基誘導(dǎo)期POD活性的升高，從而有助于不定根的形成。

2.2.2 PPO活性 由圖3可知，3 mg/L IAA處理的牡丹試管苗PPO活性在培養(yǎng)0～3 d呈上下波動(dòng)趨勢(shì)，培養(yǎng)3 d時(shí)PPO活性達(dá)到峰值，為47.50 μg/(g·min)；培養(yǎng)25 d時(shí)PPO活性達(dá)到最低值，為21.25 μg/(g·min)；生根期間PPO活性平均值為32.92 μg/(g·min)。對(duì)照處理(CK)則在培養(yǎng)0～2 d PPO活性變化趨勢(shì)與3 mg/L IAA處理一致，但活性始終較低，培養(yǎng)3 d時(shí)PPO活性達(dá)到最低值，為20.90 μg/(g·min)；培養(yǎng)6 d時(shí) PPO活性達(dá)到峰值，為44.17 μg/(g·min)；生根期間PPO活性平均值為28.75 μg/(g·min),顯著低于3 mg/L IAA處理。說明添加IAA能促進(jìn)牡丹試管苗根原基誘導(dǎo)期PPO活性的升高，從而有助于不定根的形成。

圖3 牡丹試管苗生根過程中PPO活性的變化 圖4 牡丹試管苗生根過程中IAAO活性的變化Fig.3 Changes of PPO activities during rooting of tree peony in vitro Fig.4 Changes of IAAO activities during rooting of tree peony in vitro

2.2.3 IAAO活性 由圖4可知，3 mg/L IAA處理的牡丹試管苗在培養(yǎng)6 d IAAO活性達(dá)到最低值，為59.92 μg/(g·h)，其次是培養(yǎng)4 d，IAAO活性為60.69 μg/(g·h)；培養(yǎng)25 d IAAO活性達(dá)到峰值，為100.03 μg/(g·h)；生根期間IAAO活性平均值為73.87 μg/(g·h)。對(duì)照處理(CK)牡丹試管苗在生根培養(yǎng)2 d時(shí)IAAO活性達(dá)到最低值，為57.25 μg/(g·h)，其次是培養(yǎng)1 d，IAAO活性為63.85 μg/(g·h)；培養(yǎng)20 d時(shí)IAAO活性達(dá)到峰值，為96.17 μg/(g·h)；生根期間IAA活性平均值為74.14 μg/(g·h)。說明添加IAA后，牡丹試管苗在根原基誘導(dǎo)期IAAO活性處于較低水平，有助于不定根的發(fā)生。

2.3 牡丹試管苗生根期間內(nèi)源激素IAA的變化

牡丹試管苗生根期間莖基部?jī)?nèi)源IAA含量的變化見圖5。

圖柱上標(biāo)不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)Different letters show significant difference between treatments at P<0.05圖5 牡丹試管苗生根期間莖基部?jī)?nèi)源IAA含量的變化Fig.5 Changes of endogenous IAA content at the base of stem during rooting of tree peony in vitro

由圖5可知，生根培養(yǎng)基中加入3 mg/L IAA的處理，在生根誘導(dǎo)0 d時(shí)，牡丹試管苗莖基部IAA含量較低，之后其含量持續(xù)升高，且在培養(yǎng)5 d達(dá)到最高，之后呈下降趨勢(shì)，在培養(yǎng)25 d IAA含量最低。對(duì)照處理(CK)牡丹試管苗莖基部IAA含量的整體變化趨勢(shì)與3 mg/L IAA處理基本一致，但在培養(yǎng)3，5和10 d時(shí)，其內(nèi)源IAA含量顯著低于3 mg/L IAA處理，說明生根培養(yǎng)基中添加IAA后,牡丹試管在根原基形成期內(nèi)源IAA含量明顯升高。

2.4 牡丹試管苗生根期間莖基部細(xì)胞學(xué)觀察及IAA的免疫熒光定位

由圖6可知，牡丹莖基部橫切面從外到內(nèi)依次為表皮、皮層和維管束。在牡丹試管苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)0 d時(shí)，莖基部細(xì)胞排列疏松整齊，未見潛在根原基的存在(圖6-A)；培養(yǎng)3 d時(shí)在維管束周圍和皮層薄壁細(xì)胞周圍有密集的細(xì)胞團(tuán)形成，開始出現(xiàn)根原基，根原基的發(fā)生方式有2種：愈傷組織(圖6-B)和維管束(圖6-C)；培養(yǎng)5 d時(shí)根原基明顯，且開始向皮層生長(zhǎng)(圖6-D)；培養(yǎng)10～15 d根原基持續(xù)伸長(zhǎng)(圖6-E,F)，20 d逐漸延伸至表皮(圖6-G)，25 d形成完整的根(圖6-H)。由熒光強(qiáng)度可知，在生根培養(yǎng)0 d時(shí)牡丹試管苗莖基部中IAA以維管束分布為主(圖6-a)；在培養(yǎng)3 d時(shí)，熒光主要聚集于根原基發(fā)生的部位，在表皮也有較弱的熒光，仍以維管束分布為主(圖6-b,c)；培養(yǎng)5 d時(shí)熒光信號(hào)整體增強(qiáng)，根原基熒光信號(hào)明顯，且皮層也開始出現(xiàn)大量熒光信號(hào)(圖6-d)；在培養(yǎng)10～15 d時(shí)熒光逐漸變?nèi)酰以诟蚱友由斓母庵車罅糠植?，同時(shí)表皮的熒光信號(hào)增強(qiáng)(圖6-e,f)；培養(yǎng)20 d時(shí)熒光信號(hào)繼續(xù)減弱，皮層中基本無熒光信號(hào)(圖6-g)；培養(yǎng)25 d時(shí)不定根上存在較強(qiáng)的熒光信號(hào)(圖6-h)。

A-H.牡丹試管苗生根培養(yǎng)期間的明場(chǎng)照片;A.0 d；B,C.3 d；D.5 d；E.10 d；F.15 d；G.20 d；H.25 d;a-h.為與A-H對(duì)應(yīng)的熒光照片；Co.皮層；Vc.維管形成層；Ph.韌皮部；Xy.木質(zhì)部；Pi.髓；Rp.根原基；Ca.愈傷組織；Ar.不定根A-H were are field maps during rooting period；A.0 d；B,C.3 d；D.5 d；E.10 d；F.15 d；G.20 d；H.25 d;a-h are fluorescent images of A-H；Co.Cortex;Vc.Vascular cambium;Ph.Phloem;Xy.Xylem;Pi.Pith;Rp.Root primordium;Ca.Callus;Ar.Adventitious roots圖6 牡丹試管苗生根期間莖基部的IAA免疫熒光定位(40×)Fig.6 IAA immunofluorescence localization of stem base during rooting of tree peony in vitro (40×)

3 討 論

植物不定根形成的主要過程是薄壁細(xì)胞脫分化形成潛在的發(fā)根點(diǎn)后，經(jīng)過細(xì)胞分裂和形成層增大，最后形成根原基[8]。通過細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，牡丹試管苗生根培養(yǎng)3～5 d為根原基誘導(dǎo)的關(guān)鍵時(shí)期，莖基部POD活性在培養(yǎng)3 d時(shí)達(dá)到峰值，表明POD活性升高可促進(jìn)根原基的誘導(dǎo)，這與大部分研究認(rèn)為POD活性升高可促進(jìn)生根的結(jié)果[22-23]一致。牡丹試管苗莖基部PPO活性在生根培養(yǎng)3 d時(shí)達(dá)到峰值，且添加3 mg/L IAA的處理在生根關(guān)鍵期(3～5 d)PPO活性始終高于對(duì)照，表明高活性的PPO可促進(jìn)根原基的誘導(dǎo)，這可能是添加IAA的處理在PPO作用下促進(jìn)了IAA與酚類物質(zhì)的結(jié)合，形成了進(jìn)一步促進(jìn)生根的輔助因子[24]。生長(zhǎng)素促進(jìn)生根的主要原因與形成層誘導(dǎo)的第1次細(xì)胞分裂有關(guān)，生長(zhǎng)素含量高峰與根原基出現(xiàn)在同一時(shí)期[25]。本研究中，牡丹試管苗培養(yǎng)3 d時(shí)莖基部的IAA含量大幅上升，5 d時(shí)達(dá)到峰值，且在培養(yǎng)3～4 d時(shí)IAAO活性處于下降趨勢(shì)，這有利于莖基部IAA的積累，表明IAA含量高可促進(jìn)細(xì)胞分化從而形成根原基。生根培養(yǎng)5 d后根原基開始逐漸伸長(zhǎng)，最終突破表皮，此階段中莖基部的IAA含量顯著低于3～5 d，表明莖基部低含量的IAA有利于根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，這與于雪飛等[26]、歐陽(yáng)芳群等[27]的研究結(jié)果一致。

在探究IAA在植物體內(nèi)的作用機(jī)理時(shí)，首先必須明確其在植物器官的作用位點(diǎn)和分布特征。免疫熒光定位技術(shù)能揭示內(nèi)源IAA的分布位置，目前已有部分學(xué)者進(jìn)行了這方面的研究，如Dinis等[10]通過免疫熒光技術(shù)，對(duì)葡萄葉片中的IAA和ABA進(jìn)行了原位分析；de Almeida等[28]對(duì)桉樹組培苗莖基部進(jìn)行免疫熒光定位后發(fā)現(xiàn)，IAA在根原基的積累促進(jìn)了不定根的形成，且易生根的桉樹中IAA含量是難生根桉樹中的2倍。王清民[29]研究發(fā)現(xiàn)，核桃子葉在誘導(dǎo)生根前IAA主要分布在維管組織和未成熟的導(dǎo)管細(xì)胞中，根原基形成期維管組織中IAA分布逐漸減少，而根原基中IAA熒光信號(hào)變強(qiáng)，不定根伸長(zhǎng)期根尖生長(zhǎng)點(diǎn)的IAA最多。本研究中，在牡丹試管苗生根誘導(dǎo)開始前(0 d)，IAA主要分布在維管束周圍；在根原基誘導(dǎo)期，莖基部IAA的熒光信號(hào)逐步變強(qiáng)，且主要分布于維管束的根原基周圍，根原基周圍的皮層中也有IAA的分布；之后在維管束中熒光信號(hào)逐漸變?nèi)?，但I(xiàn)AA在根原基向皮層延伸的根尖周圍大量分布，同時(shí)表皮的熒光信號(hào)增強(qiáng)；當(dāng)不定根突破表皮后，IAA信號(hào)主要聚集于根尖。上述免疫熒光分析表明，IAA作用于牡丹試管苗根系發(fā)生時(shí)，首先在維管束周圍大量分布，刺激根原基的形成；根原基形成后逐步向皮層、根尖形成部位以及皮層分布，促進(jìn)根的伸長(zhǎng)，且在誘導(dǎo)期熒光信號(hào)最強(qiáng)。研究表明，核桃組培苗在根系誘導(dǎo)中不定根形成前期，內(nèi)源IAA含量在短時(shí)間內(nèi)急速升高，但對(duì)IAA的作用位點(diǎn)并未說明[30]。本研究表明，牡丹試管苗在根系發(fā)生誘導(dǎo)期，莖基部IAA信號(hào)強(qiáng)烈，且發(fā)現(xiàn)牡丹不定根發(fā)生起源于微管形成層和皮層愈傷組織，此時(shí)微管束和皮層中有根原基出現(xiàn)時(shí)，IAA也大量聚集于此，這與de Almeida等[28]和王清民[29]的研究結(jié)果一致，表明IAA在根原基的積累與不定根發(fā)生密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

牡丹試管苗在生根培養(yǎng)3 d時(shí)根原基開始出現(xiàn)，培養(yǎng)5 d時(shí)根原基基本形成，此時(shí)添加外源IAA的生根培養(yǎng)基培育的牡丹試管苗，其POD和PPO活性呈升高趨勢(shì)，IAAO活性呈下降趨勢(shì)，這有助于根原基的發(fā)生；在根原基發(fā)生期間，內(nèi)源 IAA主要分布于根原基形成的位置，且含量呈升高趨勢(shì)，說明IAA在根原基的積累與牡丹試管苗不定根的發(fā)生密切相關(guān)。