王 靜 金 燕 董尚林 武 欣

1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院婦產科，河北張家口 075000；2.河北北方學院生命科學研究中心，河北張家口 075000；3.河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000；4.河北北方學院病理教研室，河北張家口 075000

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第二位[1]，僅次于乳腺癌。近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐年升高，并且發(fā)病逐漸低齡化，嚴重影響廣大女性的生活質量，威脅女性的健康水平[2-4]。目前在宮頸癌的臨床治療中，化療仍然是術后輔助治療的重要手段[5]。傳統(tǒng)的化療藥物大多都對機體有神經毒性、骨髓抑制等比較嚴重的毒副作用，嚴重影響患者的生活質量。所以，尋找一種化療效果好同時對機體毒副作用小的理想化療藥物是目前抗腫瘤基礎和臨床研究的熱點。奧沙利鉑（L-OHP）為第三代鉑類藥物，對多種腫瘤有效[6-8]，并且與傳統(tǒng)化療藥物比較，毒副作用小[9]。NS-398 為一種環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）選擇性抑制劑，可抑制結腸癌、胃癌、膽管癌等多種腫瘤細胞生長[10-11]。本研究將NS-398 與L-OHP 聯(lián)合作用于宮頸癌HeLa 細胞株，觀察二者聯(lián)用對HeLa 細胞的抑制作用及誘導凋亡作用，以期為臨床宮頸癌的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人宮頸癌HeLa 細胞株由河北北方學院生命科學研究中心細胞室保存。RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：1663936）；胎牛血清（Excell Bio 公司，批號：11H158）；DNA ladder 試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：C0007）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（BD 公司，批號：556547）；羅丹明染色試劑盒（凱基生物公司，批號：KGA217）；CCK-8 試劑（日本同仁化學研究所，批號：DC663）；NS-398（美國Cayman 公司，批號：70590）；L-OHP（深圳海王藥業(yè)有限公司，批號：2015060）。流式細胞儀（型號：FACS Aria，美國BD 公司）；多功能顯微鏡（型號：90i，日本尼康公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

HeLa 細胞株使用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 的RPMI 1640 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和水蒸氣。細胞鋪滿單層后，采用含EDTA 的胰蛋白酶消化傳代。實驗細胞為對數生長期細胞。

1.3 CCK-8 實驗

HeLa 細胞經胰蛋白酶消化后用RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸，接種至96 孔板（每孔2×104個細胞），置37℃、5%CO2、飽和水蒸汽條件下繼續(xù)培養(yǎng)至鋪滿單層后，分別單獨加入不同濃度NS-398（0、30、60 μmol/L）或L-OHP（0.0、2.5、5.0、10.0 mg/L），聯(lián)合用藥實驗分別加入不同濃度的NS-398（30、60 μmol/L）和LOHP（2.5、5.0、10.0 mg/L）。每組4 個重復。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔分別加入10 μL CCK-8 試劑后，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀在450 nm 處測定吸光度值（OD），計算抑制率（IR）。

1.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化

將HeLa 細胞接種至六孔板，待細胞鋪滿單層后分別加入藥物，設對照組、NS-398 組（60 μmol/L）、L-OHP 組（10 mg/L）以及聯(lián)合組（NS-398：60 μmol/L+L-OHP：10 mg/L）。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.5 羅丹明123 染色

實驗分組同“1.4”項下，藥物處理24 h 后，消化細胞，培養(yǎng)基重懸，調整細胞濃度至1×105個/mL 后，分別取1 mL 轉移至1.5 mL 離心管中，每管分別加入10 μL 羅丹明染色工作液，混勻后放入37℃溫箱中孵育20 min，離心，棄上清，PBS 洗兩次，用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞，置37℃、5%CO2、飽和水蒸汽條件下繼續(xù)培養(yǎng)60 min 后，各組分別取100 μL，滴加到潔凈載玻片上，熒光顯微鏡觀察。

1.6 DNA ladder

取對數生長期HeLa 細胞，按照分組加入藥物處理，設對照組、NS-398 組（60 μmol/L。）、L-OHP 組（10 mg/L）以及聯(lián)合組（NS-398：60 μmol/L 和L-OHP：10 mg/L）。藥物作用后24 h，按照試劑盒說明書提取基因組DNA 后，行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.7 流式凋亡率

收集藥物作用后的HeLa 細胞，實驗分組同“1.4”項下，PBS 洗滌兩次，計數后，每組取3×105個細胞，用100 μL Binding Buffer 重懸細胞。分別加入5 μL Annexin V 和5 μL PI，混勻后室溫避光孵育20 min后，加400 μL Binding Buffer 后上機檢測（激發(fā)波長Ex=488 nm；發(fā)射波長Em=530 nm）。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較，采用方差分析；兩兩比較，采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NS-398 與L-OHP 對HeLa 細胞抑制率的影響

與未加藥物組比較，NS-398 單藥組和L-OHP單藥組抑制率明顯增高，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P ＜0.01）；聯(lián)合組抑制率高于NS-398 單藥組和L-OHP 單藥組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P ＜0.01）。見表1。

表1 NS-398 與L-OHP 對HeLa 細胞抑制率的影響（%，±s,n=4）

表1 NS-398 與L-OHP 對HeLa 細胞抑制率的影響（%，±s,n=4）

注：與同濃度NS-398 單獨用藥比較，*P ＜0.01；與同濃度L-OHP 單獨用藥比較，#P ＜0.01。L-OHP：奧沙利鉑

2.2 倒置顯微鏡觀察結果

對照組細胞狀態(tài)良好，形態(tài)呈梭形，貼壁生長，細胞邊緣清晰，胞膜完整。NS-398 組細胞體積皺縮變小變圓，胞質內出現顆粒狀物質，少量細胞從瓶底脫落，漂浮于培養(yǎng)液中。L-OHP 組細胞失去正常形態(tài)，皺縮變小，培養(yǎng)液中可見死細胞。聯(lián)合組培養(yǎng)液中可見大量死細胞和細胞碎片，僅余少量細胞貼在瓶底，且形態(tài)呈不同程度的皺縮，部分細胞破裂，細胞內容物溢出。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡觀察HeLa 細胞形態(tài)變化

2.3 羅丹明123 染色結果

羅丹明123 染色結果顯示，對照組無熒光；NS-398 組、L-OHP 組與聯(lián)合組熒光強度增強，尤其以聯(lián)合組最為明顯。見圖2（封四）。

2.4 DNA Ladder 結果

聯(lián)合組有明顯的梯狀條帶出現；NS-398 組和LOHP 組有明顯的彌散現象出現；對照組即無彌散現象也無梯狀條帶出現。見圖3。

圖3 DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.5 流式細胞儀檢測HeLa 細胞早期凋亡率改變

NS-398 組和L-OHP 組凋亡率明顯高于對照組；聯(lián)合組凋亡率明顯高于NS-398 組、L-OHP組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P ＜0.01）。見表2。

表2 流式細胞儀檢測HeLa 細胞早期凋亡率改變（%，±s）

表2 流式細胞儀檢測HeLa 細胞早期凋亡率改變（%，±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.01；與NS-398 組比較，#P ＜0.01；與L-OHP組比較，△P ＜0.01。L-OHP：奧沙利鉑

3 討論

近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐年上升并且呈年輕化、低齡化的趨勢，已經成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一[12]。目前，宮頸癌的治療仍然以手術結合放化療為主，化療作為一種重要的術后輔助治療手段臨床應用廣泛，但是傳統(tǒng)的化療藥物都有比較嚴重的毒副作用；在宮頸癌的治療中，單用一種化療藥物難以達到令人滿意的治療效果，因此尋找高效且毒副作用小的化療藥物以及改進治療方案是目前臨床宮頸癌治療研究中的熱點。鉑類藥物是宮頸癌術后輔助化療的基礎用藥[13-14]，L-OHP 屬于第三代鉑類藥物，與傳統(tǒng)化療藥物比較，具有獨特的優(yōu)越性[15-17]，如無腎毒性、毒副作用輕，對腸癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤有效[18]，具有廣泛的臨床應用前景，是近幾年研究的熱點。

COX 是一種內源性前列腺素合成過程中的限速酶，有COX-1 和COX-2 兩種同工酶，其中COX-2 靜息時不表達，在受到某些因素（如生長因子、細胞因子、癌基因產物、促癌劑等）刺激時才會迅速合成。COX-2 在多種腫瘤中高表達，同時在癌旁或癌周組織不表達或者低表達[19-20]，提示COX-2 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。在宮頸癌有關的研究中也有人證實COX-2與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關[21-23]。因此COX-2 可作為宮頸癌治療的靶點之一，選擇性抑制COX-2 可以預防和治療宮頸癌。NS-398 屬于非甾體抗炎藥，是一種選擇性的COX-2 抑制劑。研究顯示[24-25]，NS-398 可以抑制COX-2 高表達的腫瘤細胞生長，誘導其凋亡，而對COX-2 低表達的腫瘤細胞則無抑制作用。

如今，誘導腫瘤細胞凋亡是抗癌藥物研究中的熱點。細胞凋亡后會發(fā)生一系列的變化：凋亡早期，細胞膜會發(fā)生磷酯酰絲氨酸外翻；凋亡晚期，DNA 規(guī)律性斷裂；凋亡過程中線粒體膜電位也會發(fā)生變化。本研究將不同濃度的NS-398 和L-OHP 及兩者聯(lián)合分別作用于HeLa 細胞，用CCK-8 法、羅丹明123 染色法、流式細胞儀等多種方法觀察兩種藥物對HeLa 細胞的影響。CCK-8 結果顯示，兩種藥物聯(lián)用的抑制率高于二者單用。羅丹明123 染色結果顯示，實驗組HeLa細胞染色后熒光強度有不同程度的增強，尤其以聯(lián)合組為著，提示各實驗組均不同程度的存在線粒體膜電位的變化和細胞凋亡的發(fā)生。DNA Ladder 結果也提示聯(lián)合組細胞處于凋亡早期階段。

綜上所述，NS-398 和L-OHP 均可抑制HeLa 細胞生長，誘導其凋亡，兩種藥物聯(lián)用對HeLa 細胞的抑制作用優(yōu)于二者單用，提示兩種藥物聯(lián)用可提高抗癌效果，為指導臨床化療提供了實驗基礎。但是僅研究NS-398 和L-OHP 對HeLa 細胞的抑制作用及誘導凋亡作用，對其誘導凋亡具體機制及二者聯(lián)用在體內對癌細胞的生物學效應未進行深入探討，這將是下一步研究的內容。