唐津天 王瑞賓 王伯慶▲

1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000

膽管細(xì)胞型肝癌是來(lái)源于肝內(nèi)膽道上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)病率較低，沒(méi)有特異性的腫瘤標(biāo)志物用于血清學(xué)診斷，糖類抗原（CA）19-9 和胚胎抗原（CEA）的增高可能有助于診斷[1]。病理表現(xiàn)為腺癌，肝外受侵表現(xiàn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和周圍神經(jīng)侵犯[2]。大多數(shù)膽管細(xì)胞型肝癌發(fā)病呈散發(fā)性，沒(méi)有特征性的風(fēng)險(xiǎn)因素[3]。目前，膽管細(xì)胞型肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確。

人類基因組研究發(fā)現(xiàn)93%的DNA 被轉(zhuǎn)錄為RNA，其中2%可翻譯成蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其余98%均為無(wú)編碼功能的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）[4-5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA 是非編碼RNA 的一種，在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多層面調(diào)控基因的表達(dá)。研究證實(shí)lncRNA 與人類多種重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-10]。本研究借助于高通量生物芯片進(jìn)行篩選分析，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，獲取與腫瘤相關(guān)lncRNAmRNA，為膽管細(xì)胞型肝癌的診斷和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集

選取2017 年1 月—6 月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）肝膽外科手術(shù)切除的5 例膽管細(xì)胞型肝癌新鮮組織標(biāo)本。標(biāo)本自手術(shù)中離體后立即取樣，注明標(biāo)識(shí)后置入液氮中保存。

5 例經(jīng)病理證實(shí)均為膽管細(xì)胞型肝癌患者，女3 例，男2 例；年齡37～55 歲，中位年齡45.2 歲；腫瘤均單發(fā)，最大徑介于2.2～4.7 cm，平均（4.2±0.3）cm，病理分期均為T1N0M0（AJCC，第8 版）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得患者及其家屬的同意。

1.2 RNA 的提取和數(shù)據(jù)處理

RNA 提取試劑盒提取樣本總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性。總RNA 質(zhì)檢合格后，樣本依次進(jìn)行標(biāo)記、芯片雜交、洗脫和染色，最后掃描獲得原始數(shù)據(jù)圖像。樣本數(shù)據(jù)分析由北京康普森生物技術(shù)有限公司支持完成。

1.3 差異mRNA 的篩選

使用Affymetrix 軟件對(duì)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)篩選條件log2|FC|≥1 且P ≤0.05，對(duì)得到的標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)值的FC 值和差異顯著性P 值進(jìn)行篩選。

1.4 lncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

Affymetrix 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后獲取差異lncRNA。對(duì)Top10 差異lncRNA 進(jìn)行共表達(dá)分析，獲得相應(yīng)的靶基因。依據(jù)Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)lncRNA 的功能。再次選取Top10 差異lncRNA 中|FC|值最高的Top1 lncRNA進(jìn)行GO 富集和Pathway 分析。

1.5 qRT-PCR 驗(yàn)證分析

另選取我院腫瘤標(biāo)本庫(kù)保存的膽管細(xì)胞型肝癌的組織標(biāo)本30 例。隨機(jī)抽取Top10 差異mRNA 中的1 個(gè)差異mRNA 進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證；對(duì)Top1 lncRNA及其共表達(dá)mRNA 進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。根據(jù)Real-Time PCR 原始檢測(cè)數(shù)據(jù)，按照F=2-△△Ct計(jì)算RNA 的相對(duì)表達(dá)量。組織RNA 的提取使用天根生化的動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：DP451）。使用Takara 的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：RR047A）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，利用Takara 的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（生產(chǎn)批號(hào)：RR420）進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)。從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)和PrimerBank 數(shù)據(jù)庫(kù)查找引物序列，委托生物公司設(shè)計(jì)合成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)表示。多組間比較選擇單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異mRNA 和lncRNA 的篩選

在篩選閾值為P ≤0.05，log2|FC|≥1 的情況下，共篩選獲得差異mRNA 475 個(gè)，其中上調(diào)mRNA 213 個(gè)，下調(diào)mRNA 262 個(gè)；共篩選獲得差異lncRNA 共計(jì)438 個(gè)，其中上調(diào)lncRNA 131 個(gè)，下調(diào)lncRNA 307 個(gè)。根據(jù)差異表達(dá)的mRNA 和lncRNA 進(jìn)行聚類分析，分析結(jié)果見(jiàn)圖1 和圖2（封四）。根據(jù)log2|FC|值，其中差異表達(dá)的Top10 mRNA 和lncRNA 見(jiàn)表1～2。

圖1 差異表達(dá)mRNA 和lncRNA 的火山圖分布

表1 排名前10 的差異表達(dá)的mRNA

表2 排名前10 的差異表達(dá)的lncRNA

2.2 mRNA-lncRNA 共表達(dá)分析

對(duì)Top10 差異lncRNA 進(jìn)行l(wèi)ncRNA 與mRNA的共表達(dá)分析，獲得相應(yīng)的靶基因。在篩選閾值為P ≤0.05，log2|FC|≥1，相關(guān)系數(shù)|cor|≥0.95 的情況下，Top10 差異lncRNA 共表達(dá)的mRNA 數(shù)目見(jiàn)表3。對(duì)Top10 lncRNA 相應(yīng)靶基因的GO 富集分析和Pathway分析，因獲得的數(shù)據(jù)信息量巨大，僅選擇Top1 lncRNA進(jìn)行GO 富集分析和Pathway 分析。

表3 排名前10 的lncRNA 共表達(dá)mRNA 數(shù)目

2.3 CPS1-IT1 的共表達(dá)分析

選擇|FC|最大值的lncRNA CPS1-IT1 進(jìn)行共表達(dá)分析。通過(guò)GO 分析最終篩選獲得與之關(guān)系密切的共表達(dá)基因是CSNK1E，同時(shí)對(duì)CPS1-IT1 的功能進(jìn)行分類（圖3）。通過(guò)Pathway 分析，獲得CPS1-IT1 相關(guān)的信號(hào)通路（圖4）。

2.4 LncRNA CPS1-IT1 的驗(yàn)證

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)30 例膽管細(xì)胞型肝癌的癌組織和癌旁正常肝組織中靶基因mRNA 和lncRNA 的表達(dá)豐度。隨機(jī)抽取Top10 mRNA 中的TC1200010108.hg.1（GYS2）和CPS1-IT1 的共表達(dá)基因CSNK1E 進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示TC1200010108.hg.1（GYS2）在癌組織中呈相對(duì)表達(dá)下調(diào)，癌組織2-△△Ct=0.5413，癌旁正常肝組織2-△△Ct=1，P ＜0.05；CSNK1E在癌組織中呈表達(dá)上調(diào)，癌組織2-△△Ct=1.8907，癌旁正常肝組織2-△△Ct=1，P ＜0.05（圖5）。同時(shí)對(duì)Top1 lncRNA 進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示CPS1-IT1 在癌組織中呈相對(duì)表達(dá)下調(diào)，癌組織2△△Ct=0.2973，癌旁正常肝組織2-△△Ct=1，P ＜0.05（圖5）。

圖3 lncRNA CPS1-IT1 的功能分類

圖4 lncRNA CPS1-IT1 共表達(dá)基因Pathway 分類圖

圖5 CPS1-IT1、GYS、CSNK1E 在組織RNA 中的表達(dá)水平

3 討論

本研究通過(guò)生物芯片對(duì)膽管細(xì)胞型肝癌標(biāo)本組織進(jìn)行高通量分析，結(jié)果顯示在篩選閾值為P ≤0.05，log2|FC|≥1 的情況下，下調(diào)表達(dá)的差異mRNA 多于上調(diào)表達(dá)的差異mRNA。同樣的情況在lncRNA 中更為明顯，在共計(jì)438 個(gè)差異lncRNA 中，下調(diào)表達(dá)的差異lncRNA 為307 個(gè)，上調(diào)表達(dá)的差異lncRNA 僅為131 個(gè)，這種表達(dá)趨勢(shì)在Top10 差異mRNA 和lncRNA中更加明顯。對(duì)Top10 差異mRNA 進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)mRNA 涉及糖代謝和脂代謝。例如，HSD17B13為蛋白編碼基因，與脂質(zhì)代謝相關(guān)[11]。GYS2 為肝糖原合成酶，是糖代謝信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白之一，在胰島素信號(hào)通路和糖原代謝信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。GYS2 表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致下游肝糖原合成不足，加速細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，符合惡性腫瘤對(duì)葡萄糖高代謝的特征[12]。CFHR4 則與脂質(zhì)的運(yùn)輸密切相關(guān)。APOF 參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，與脂蛋白代謝密切相關(guān)[13]。THRSP 在脂質(zhì)合成中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，特別是對(duì)中長(zhǎng)鏈脂肪酸的三酰甘油合成具有重要意義[14]。由此可見(jiàn)，在肝膽管細(xì)胞型肝癌中，腫瘤組織的糖代謝和脂質(zhì)代謝紊亂相對(duì)明顯。

因高通量分析后獲得的數(shù)據(jù)信息量巨大，因此本研究依據(jù)差異倍數(shù)，選擇Top1 lncRNA 進(jìn)一步分析。CPS1-IT1 位于編碼氨甲酰磷酸合成酶1 基因的內(nèi)含子，是近年來(lái)確定的新的腫瘤相關(guān)分子，主要功能角色尚不清楚，目前已經(jīng)在部分腫瘤中進(jìn)行了探索性研究。研究發(fā)現(xiàn)，CPS1-IT1 在肺癌中具有抑制腫瘤的作用，其過(guò)表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[15]。此外，CPS1-IT1 在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著降低，通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α 活性抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制肝癌轉(zhuǎn)移[16]。進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)oxa2 表達(dá)增加促進(jìn)CPS1-IT1上調(diào)，降低HIF-1α 的活性，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。在卵巢癌的研究中也證實(shí)CPS1-IT1 是一種保護(hù)性的預(yù)后因子[18]。

對(duì)CPS1-IT1 進(jìn)行共表達(dá)分析，最終篩選獲得CPS1-IT1 的共表達(dá)基因?yàn)镃SNK1E。通過(guò)CPS1-IT1的功能分析發(fā)現(xiàn)，CPS1-IT1 及其共表達(dá)mRNA 網(wǎng)絡(luò)可能參與有絲分裂細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換、Wnt 信號(hào)通路的調(diào)控、晝夜節(jié)律基因表達(dá)的調(diào)節(jié)等。此外，通過(guò)Pathway分析發(fā)現(xiàn)，CPS1-IT1 和其共表達(dá)基因CSNK1E，通過(guò)FOXO 信號(hào)通路參與糖酵解、葡萄糖異生等；通過(guò)Wnt 信號(hào)通路參與細(xì)胞周期的調(diào)控；通過(guò)Hedgehog 信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖；通過(guò)Hippo 信號(hào)通路參與蛋白質(zhì)水解調(diào)控；通過(guò)晝夜節(jié)律通路參與生物鐘基因的調(diào)控。

酪蛋白激酶1E（casein kinase 1 epsilon，CSNK1E）可以作用于底物酪蛋白使其磷酸化，主要參與Wnt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，也是生理性晝夜時(shí)鐘調(diào)控的核心成員之一[19-20]。生物鐘基因突變常與代謝缺陷有關(guān)，包括糖酵解途徑、脂肪酸合成、脂肪酸氧化和細(xì)胞解毒等，特別是在脂質(zhì)和葡萄糖代謝方面[20-25]。這些數(shù)據(jù)表明，晝夜節(jié)律和代謝途徑的相互協(xié)調(diào)對(duì)于細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和機(jī)體健康是至關(guān)重要的。

本研究顯示，膽管細(xì)胞型肝癌的糖代謝和脂質(zhì)代謝紊亂相對(duì)明顯，其機(jī)制之一可能是通過(guò)lncRNA CPS1-IT1 和共表達(dá)基因CSNK1E 介導(dǎo)下調(diào)控腫瘤的葡萄糖和脂質(zhì)代謝，具體的信號(hào)通路仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。