劉 敏 王小燕 賈瑞琳 任存霞

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059

慢性盆腔炎（CPID）是女性上生殖道及其周圍結(jié)締組織的感染，包含子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、盆腔腹膜炎等，是一組炎癥性疾病。流行病學調(diào)查顯示，盆腔炎性疾病發(fā)生對象以20～35 歲年輕的育齡期女性為主，是影響現(xiàn)代女性生活質(zhì)量的一大棘手問題。本病還與性文化、性教育、社會發(fā)展、婚姻道德觀等因素密切相關[1-2]，若失治、誤治給個人、家庭以及社會帶來的影響是難以預估的。當歸芍藥散方出自《金匱要略》，研究報道該方對女子經(jīng)、帶、胎、產(chǎn)在內(nèi)的諸多病癥均見療效[3-5]，是中藥治療盆腔炎性疾病的經(jīng)典處方之一。本實驗前期[6-8]結(jié)果提示，當歸芍藥散可通過改善機體免疫來達到抗炎抗粘連作用；原方組成優(yōu)化取芍藥、川芎、澤瀉、茯苓、白術(shù)劑量比為10∶5∶5∶4∶4 時其抗CPID 效果較佳。赤瓟子善治血瘀胞宮、經(jīng)閉、胎衣不下等婦科病，對血脈病、瘡癰、筋骨疼痛等多病種有效[9-11]，是蒙醫(yī)婦科疾病經(jīng)典用藥。赤瓟子還具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抑制腫瘤等多種藥理作用[12]。本實驗采用經(jīng)方優(yōu)化藥味聯(lián)合經(jīng)典蒙藥的模式，探索新方對CPID大鼠的治療作用，以期為臨床抗CPID 藥物的研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

微量高速離心機（型號：TG16W）；酶標儀：北京普朗新技術(shù)有限公司（型號：DNM-9602）；光學顯微鏡：日本尼康公司（型號：Eclipse E200）。HE 染液試劑，北京博奧拓達科技有限公司（批號：20170916）。ELISA試劑盒：北京博奧森生物技術(shù)有限公司[白細胞介素-1β（IL-1β）貨號：DRE20024；IL-10 貨號：DRE20095；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）貨號：DRE20040]。金剛藤膠囊：湖北福人藥業(yè)公司產(chǎn)，0.5 g/粒（批號：20171016）?；旌霞毦芤海簝?nèi)蒙古醫(yī)科大學微生物室培育，將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌制成比例為2∶1∶1 濃度約為3×109個/mL 混懸液。

1.2 方法

1.2.1 動物及分組 70 只SPF 清潔級SD 雌性大鼠，體重180～220 g，設置正常組，模型組，金剛藤膠囊組，蒙藥赤瓟子組，新方高、中、低劑量組，每組10 只，由內(nèi)蒙古大學動物研究中心培育[許可證號：SCXK（蒙）2001-0001]。

1.2.2 CPID 模型復制 大鼠標號、稱重，腹腔注射麻醉，取腹直線與恥骨聯(lián)合交點直上1 cm 處為切口，暴露出大鼠“Y”型子宮。配好的混合細菌分別注入兩側(cè)宮腔內(nèi)，每側(cè)0.1 mL 量，同時用利器尖端劃傷子宮內(nèi)膜，完成操作后縫合腹腔。CPID 造模成功標準：肉眼觀察宮腔與周圍結(jié)締組織粘連，可見宮腔積液；鏡下觀察子宮病理切片，內(nèi)膜缺損，可見脫落、壞死細胞，腺體萎縮、減少，間質(zhì)內(nèi)可見大量炎癥細胞浸潤等。

1.2.3 給藥 新方按3∶10∶5∶4∶4∶5 配比依次稱取赤瓟子10 g、芍藥30 g、川芎15 g、白術(shù)12 g、茯苓12 g、澤瀉15 g，臨床用量94 g/d，以成人體重（60 kg）為標準，得出給藥量為1.57 g/kg，大鼠等效劑量換算約為成人6.3 倍[13]，新方高、中、低劑量組分別以12.6、6.3、3.15 倍藥量換算，含生藥量分別為19.74、9.87、4.93 g/kg，按10 mL/kg 為給藥體積，得出高劑量組藥液為1.97 g/mL，按需配制其他劑量組。金剛藤膠組：臨床每天藥量為6 g，同法得出6.3 倍等效藥量即0.63 g/kg，大鼠灌胃給藥體積不變，得出金剛藤膠囊藥液為0.06 g/mL（即0.5 g 配液8 mL）。蒙藥赤瓟子組：常規(guī)量10 g/d，同法算出等效藥量為1.04 g/kg，配置藥液是0.10 g/mL。

1.3 觀察指標

血清學：大鼠腹主動脈血3～5 mL，靜置30 min后離心（轉(zhuǎn)速3500 r/min），取上清液在室溫下酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）雙抗體夾心法測定血清IL-1β、IL-10、TNF-α。組織學：雙側(cè)子宮標本于15 mL 中性甲醛溶液固定。脫水硬化處理、石蠟包埋、切片（4～6 μm）、HE 染色。顯微鏡下觀察大鼠宮腔壁結(jié)構(gòu)、腺體排列、炎癥細胞侵潤情況，上述觀察指標進行病理學評分，設置4 個病變程度為無（-）、輕（+）、中（++）、重（+++），依次計0、1、2、3 分[14]。見表1。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組均數(shù)比較選方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 法或Dunnett T3法。計數(shù)資料以例數(shù)表示。等級資料用非參數(shù)秩和檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 子宮結(jié)構(gòu)病變程度評價

2 結(jié)果

2.1 子宮組織病理學觀察

光學顯微鏡下觀察，正常組子宮腔結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜層組織形態(tài)正常，腺體排列有序，基底層致密、紋理清晰（圖1a）；模型組子宮黏膜層變薄，內(nèi)膜變形缺損，可見有脫落、壞死細胞，腺體萎縮，子宮全層可見炎性浸潤（圖1b）；金剛藤膠囊組可見散在炎癥細胞浸潤（圖1c）；新方高劑量組見內(nèi)膜增生樣改變，基底層致密，腺體結(jié)構(gòu)完整，視野內(nèi)炎癥細胞浸潤少（圖1d）；新方中劑量組可見腺體排列較完整，少量炎癥細胞浸潤（圖1e）；新方低劑量與蒙藥赤瓟子組可見脫落、壞死細胞，腺體萎縮，黏膜層損壞，炎癥細胞大量浸潤（圖1f、1g）。病理學評分顯示：與正常組比較，模型組子宮病理學積分顯著升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。金剛藤組、新方高、中劑量組病理積分較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。

2.2 各組大鼠血清IL-1β、IL-10、TNF-α 比較

圖1 各組子宮組織HE 染色（40×）

表2 各組子宮病理學積分比較（例，n=10）

與正常組比較，模型組IL-10 含量降低，IL-1β及TNF-α 含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），提示CPID 造模成功。與模型組比較，新方高、中劑量組IL-10 含量升高，新方高中、中、低劑量組IL-1β 與TNF-α 含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。與金剛藤組比較，新方低劑量組IL-10 降低，IL-1β 升高，新方高、中劑量TNF-α 含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。與蒙藥赤瓟子組比較，新方高、中劑量IL-10 升高，IL-1β 降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-10、TNF-α 比較（±s，n=10）

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-10、TNF-α 比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與金剛藤組比較，cP ＜0.05；與蒙藥赤瓟子比較，dP ＜0.05。IL：白細胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子α

3 討論

CPID 屬中醫(yī)“帶下”“腹痛”病范疇，是由瘀與濕侵犯引起的“血水同病”，當歸芍藥散藥物組成特點恰為“肝脾同調(diào)，血水同治”，方隨證立，臨床報道證實該方治療CPID 取得顯著效果[15-17]。蒙醫(yī)學認為赫依運行紊亂，瘀血、黃水、黏熱或寒邪相互搏結(jié)可引發(fā)CPID，臨床上蒙藥聯(lián)合西藥能夠有效改善CPID 癥狀、降低經(jīng)濟成本、減少復發(fā)率[18-21]。近年來，針對盆腔炎性疾病的防治是婦科領域研究的熱點與難點，單純采用西藥、中藥或蒙藥的治療模式已經(jīng)不能滿足臨床日益增長的需求。因此，聯(lián)合用藥將會是防治CPID的更優(yōu)選擇[22-23]。

CPID 的發(fā)生與炎癥因子的異常表達有關，慢性病程階段的病理改變也是由異常的免疫應答所致[24-25]，本研究選取TNF-α、IL-1β 及IL-10 3 個相關細胞因子進行研究。TNF-α 過度分泌會誘導其他炎癥介質(zhì)的異常表達，促使炎癥持續(xù)反應并引起組織受損。TNF-α 還可誘導細胞間黏附分子大量聚集，加速組織的增生與粘連。IL-1β 主要介導組織破壞與水腫，IL-1β高表達提示機體存在感染與損傷。IL-10 能發(fā)揮抑制炎癥作用，可抑制TNF-α、IL-1β 等促炎癥因子合成與釋放，緩解炎癥。本實驗結(jié)果顯示，模型組血清IL-10含量減少，TNF-α、IL-1β 含量均升高，新方高、中劑量組與金剛藤組IL-1β 含量降低，IL-10 含量升高，提示以上用藥組可有效抑制促炎因子表達、升高抗炎因子表達，對紊亂的炎癥因子具有一定調(diào)節(jié)作用，對CPID 起到積極治療作用。除金剛藤膠囊組外，各給藥組明顯降低TNF-α 含量，提示新方與蒙藥赤瓟子可改善CPID 局部組織粘連情況。新方對CPID 模型大鼠可發(fā)揮治療作用機制可能與上調(diào)IL-10 因子表達，下調(diào)TNF-α、IL-1β 因子表達相關。