劉晨陽 張成 楊婕 孫韜

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)作為EGFR陽性肺癌患者治療的一線靶向用藥，能顯著延長晚期患者生存時間，改善患者生活質(zhì)量。然而EGFR-TKI抵抗的形成，嚴(yán)重影響了其療效[1]，其形成的機制復(fù)雜，涉及EGFR突變、c-Myc基因擴增及腫瘤干細(xì)胞等。非編碼RNA作為表觀遺傳的重要執(zhí)行者，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。成熟的miRNA通過與其互補的mRNA結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)靶mRNA的降解或抑制其翻譯[2]。miR-145可靶向c-Myc、Oct4及AKT等原癌基因，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[3-5]，因此，揭示miR-145的調(diào)控機制對于腫瘤的早期診斷及治療方案的評估至關(guān)重要，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度>200nt的非編碼RNA，其可作為內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)，抑制miRNA的生物學(xué)效應(yīng)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性行為及藥物抵抗[6-7]。本研究通過生物信息技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與miR-145潛在結(jié)合的lncRNA LINC00628，并對其與miR-145的結(jié)合作用及與肺腺癌細(xì)胞EGFR-TKI抵抗的關(guān)系進(jìn)行了探究。

資料與方法

一、實驗材料

1 實驗細(xì)胞及試劑 人肺腺癌細(xì)胞系PC9(上海生科院細(xì)胞資源中心)，RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS，美國Gibco)，吉非替尼(Gefitinib，美國MCE)，LINC00628 小干擾RNA(small interference RNA LINC00628，siLINC)及隨機序列對照表達(dá)載體(上海吉凱基因)，LINC00628過表達(dá)載體、miR-145過表達(dá)載體及空白載體(上海漢恒生物)，合成miR-145 NC及mimics(上海漢恒生物科技)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Thermo Fisher)，psiCHECK2載體及Luciferase Assay Reagent II試劑盒(美國Promega)，CCK-8試劑(日本同仁化學(xué))，RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit及SYBR Green I(日本Takara)，GAPDH、c-Myc及AKT抗體(美國Proteintech)。

2 臨床組織來源 收集2019年7月至2019年12月我院普胸外科54例肺腺癌患者腫瘤組織及癌旁組織，取材后取部分組織置于液氮罐中保存，54例患者中男性30例，女性24例；年齡36～71歲，中位年齡51歲；包括高分化腺癌11例，中低分化腺癌43例；Ⅰ～Ⅱ期患者25例，Ⅲ～Ⅳ期患者29例，所有患者均為首次發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性肺腺癌，術(shù)前未經(jīng)抗腫瘤治療。

二、實驗方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 PC9細(xì)胞采用90% RPMI-1640+10% FBS培養(yǎng)于37℃+5% CO2+100%相對濕度的環(huán)境中。將PC9細(xì)胞傳代后分為7組：對照組(Control組)、吉非替尼抵抗組(Gefitinib resistance，GR組)，干擾組(small interference LINC00628，siLINC組)、干擾對照組(siControl組)，空白組(Blank組)、過表達(dá)組(miR-145組)及回復(fù)組(Rescue組)。GR組采用0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L吉非替尼逐步誘導(dǎo)PC9細(xì)胞GR的形成，每個濃度梯度維持培養(yǎng)2周以上，直至細(xì)胞在3.2 μmol/L吉非替尼中維持良好的生長狀態(tài)，90% RPMI-1640+10% FBS繼續(xù)培養(yǎng)48 h；Control組予以同步的二甲基亞砜(DMSO)處理；siLINC組采用Lipofectamine 2000介導(dǎo)LINC00628 小干擾RNA載體轉(zhuǎn)染于GR細(xì)胞中；siControl組轉(zhuǎn)染對照表達(dá)載體于GR細(xì)胞中；Blank組轉(zhuǎn)染空白載體于GR細(xì)胞中；miR-145組轉(zhuǎn)染miR-145過表達(dá)載體于GR細(xì)胞中；Rescue組共轉(zhuǎn)染LINC00628過表達(dá)載體及miR-145過表達(dá)載體于GR細(xì)胞中，均使用1 μg/mL 嘌呤霉素篩選1周。

2 實時熒光定量PCR(qPCR) RNAiso Plus提取組織或細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，miR-145特異性逆轉(zhuǎn)錄引物序列，各待檢測基因的合成引物序列如下(由上海生工提供)：LINC00628：上游5′-AGAGCGAGCAGGATGAGATAGT-3′、下游5′-GTGAGCAAGGAAGTTGACAGTG-3′；miR-145：上游5′-CAGCATACATGATTCCTTGTA-3′、下游5′-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3′； c-Myc：上游5′-CCTGGTGCTCCATGAGGAGAC-3′、下游5′-CAGACTCTGACCTTTTGCCAGG-3′； AKT1：上游5′-GGACAACCGCCATCCAGACT-3′、下游5′-GCCAGGGACACCTCCATCTC-3′；GAPDH：上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′ 、下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。10 μL核酸熒光染料體系進(jìn)行qPCR反應(yīng)，每組設(shè)置3個平行孔，以GAPDH作為內(nèi)參基因，2(-ΔΔCT)法計算LINC00628、miR-145、c-Myc及AKT1 mRNA的表達(dá)水平。

3 蛋白質(zhì)印記技術(shù)(Western Blot) 收集細(xì)胞總蛋白，每組細(xì)胞取30 μg總蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，穩(wěn)壓100V；轉(zhuǎn)PVDF膜，穩(wěn)流250 mA，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，c-Myc、AKT1及GAPDH抗體1 ∶1 000孵育目的條帶4℃過夜，1 ∶2 000二抗室溫孵育1 h，Bio-rad ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行曝光顯影。

4 CCK-8實驗 接種各組細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞濃度均為1 000個細(xì)胞/孔，設(shè)置0、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L吉非替尼濃度梯度，每組每個梯度設(shè)置5個重復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑，避光培養(yǎng)4 h，檢測450 nm處吸光度，計算細(xì)胞吉非替尼半抑制濃度(Inhibitory concentration 50%，IC50)。

5 熒光素酶報告基因?qū)嶒?連接LINC00628預(yù)測結(jié)合位點區(qū)域序列于psiCHECK2載體，培養(yǎng)293T細(xì)胞并分為2組：分別為miR-145 NC組及miR-145 mimics組，通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染miR-145 NC及psiCHECK2 LINC00628載體于miR-145 NC組細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染miR-145 mimics及psiCHECK2 LINC00628載體于miR-145 mimics組細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48h后加入200 μL裂解液室溫?fù)u轉(zhuǎn)孵育30 min，取10 μL加入96孔板，100 μL預(yù)混Luciferase Assay Reagent Ⅱ檢測熒光強度為RLU1，100 μL預(yù)混Stop&Glo Reagent檢測熒光強度為RLU2，以RLU1/RLU2作為各組細(xì)胞的相對熒光強度。

6 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究使用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，單因素方差分析(One Way ANOVA)及LSD兩兩比較進(jìn)行組間差異分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

一、肺腺癌臨床組織中LINC00628的表達(dá)情況

生物信息分析(數(shù)據(jù)平臺：gepia.cancer-pku.cn/index.html)發(fā)現(xiàn)LINC00628在肺腺癌中高表達(dá)(圖1A)，同時高表達(dá)LINC00628的肺腺癌患者預(yù)后時間顯著縮短(圖1B)，肺腺癌臨床樣本中同樣發(fā)現(xiàn)LINC00628高表達(dá)(圖1C)。

二、各組細(xì)胞中吉非替尼IC50的比較：CCK-8分析結(jié)果顯示，Control組、GR組、siControl組及siLINC組，吉非替尼IC50分別為0.46±0.07、6.41±0.83、6.08±0.85及3.29±0.46 μmol/L，相比Control組，GR組、siControl組及siLINC組吉非替尼IC50均顯著升高(P<0.05)；相比siControl組，siLINC組吉非替尼IC50顯著降低(P<0.05)(見圖2A)。Blank組、miR-145組及Rescue組IC50分別為6.27±0.69、2.94±0.50及6.33±0.73 μmol/L，miR-145組吉非替尼IC50顯著低于Blank組及Rescue組(P<0.05)(見圖2B)。

三、各組細(xì)胞中LINC00628、miR-145、c-Myc及AKT1 mRNA的表達(dá)水平

qPCR結(jié)果顯示，相比Control組，GR組LINC00628、c-Myc及AKT1 mRNA表達(dá)水平顯著增高，miR-145表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；相比siControl組，siLINC組LINC00628、c-Myc及AKT1 mRNA表達(dá)水平顯著降低，而miR-145表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)(見圖3A)；相比miR-145組，Blank及Rescue組miR-145表達(dá)顯著降低，c-Myc及AKT1 mRNA表達(dá)顯著增高(P<0.01)(見圖3B)。

圖1 肺腺癌臨床組織中LINC00628的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

圖2 各組細(xì)胞吉非替尼IC50的擬合曲線

圖3 各組細(xì)胞LINC00628、miR-145、c-Myc及AKT1 mRNA的表達(dá)及比較

四、各組細(xì)胞中c-Myc及AKT1蛋白表達(dá)水平

Western Blot結(jié)果顯示，相比Control組，GR組c-Myc及AKT1蛋白表達(dá)水平顯著增高；相比siControl組，siLINC組c-Myc及AKT1蛋白表達(dá)水平顯著降低(見圖4A、B)。相比miR-145組，Blank及Rescue組c-Myc及AKT1蛋白表達(dá)顯著增高(見圖4C、D)。

五、LINC00628與miR-145結(jié)合的驗證

生物信息數(shù)據(jù)庫(lncRNABase)預(yù)測發(fā)現(xiàn)LINC00628轉(zhuǎn)錄本715-721位點與miR-145堿基互補配對，通過構(gòu)建LINC00628熒光素酶報告基因載體，發(fā)現(xiàn)miR-145 mimics可顯著降低LINC00628-psiCHECK2的熒光信號(見圖5)。

圖4 各組細(xì)胞中c-Myc及AKT1蛋白印記

圖5 LINC00628與miR-145結(jié)合位點的預(yù)測及驗證

討 論

miR-145的低表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)，包括卵巢癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌及非小細(xì)胞肺癌等[3-5, 8-9]，同時，有研究指出，在肺腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-145后可使EGFR和NUDT1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，并抑制細(xì)胞增殖，另外miR-145在野生型或T790M點突變的EGFR肺癌細(xì)胞株中表達(dá)顯著低于突變型EGFR細(xì)胞株，這提示miR-145的低表達(dá)與EGFR-TKI藥物抵抗相關(guān)[10]。lncRNA作為機體表觀遺傳的重要執(zhí)行者，通過競爭性結(jié)合miRNA，間接調(diào)控mRNA的表達(dá)，目前已發(fā)現(xiàn)LET、ROR、SNHG1、MALAT1等lncRNA參與調(diào)控miR-145，進(jìn)而在惡性腫瘤中發(fā)揮生物學(xué)作用[11-13]，但在肺癌中的相關(guān)調(diào)控機制仍有待探索。我們通過lncRNABase數(shù)據(jù)庫在肺腺癌細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC00628與miR-145存在可能的結(jié)合作用，同時GEPIA數(shù)據(jù)平臺指出LINC00628在肺腺癌組織中高表達(dá)，并與患者預(yù)后不良相關(guān)，提示其在肺腺癌中的研究價值。

已有研究顯示，LINC00628參與影響乳腺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌及骨肉瘤細(xì)胞的惡性行為，D.Q. Chen等[14]研究顯示，LINC00628在乳腺癌組織中低表達(dá)，并與患者預(yù)后時間正相關(guān)，體外過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系LINC00628可抑制細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，該效應(yīng)與Caspase-3及Bax蛋白表達(dá)增加有關(guān)；Zi-Zhen Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)LINC00628可促進(jìn)組蛋白H3第27位賴氨酸上三甲基化(H3K27me3)水平，抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖能力；另外，LINC00628也在肝細(xì)胞癌及骨肉瘤組織中低表達(dá)，并通過抑制VEGFA及PI3K/Akt通路在其中發(fā)揮抑癌效應(yīng)[16-17]。這提示LINC00628與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其與肺癌的關(guān)系仍不明確。因此，我們對其在肺腺癌中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了探究，GEPIA數(shù)據(jù)庫及臨床標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)LINC00628在肺腺癌組織中高表達(dá)，并觀察到LINC00628的高表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后不良?？紤]到LINC00628與miR-145在肺腺癌細(xì)胞中存在潛在的相互作用以及miR-145與EGFR-TKI抵抗的密切關(guān)系，我們利用EGFR突變的肺腺癌細(xì)胞PC9作為體外模型構(gòu)建了吉非替尼抵抗細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)GR細(xì)胞LINC00628與c-Myc及AKT1表達(dá)均上調(diào)，而miR-145表達(dá)顯著降低，提示LINC00628可能參與肺腺癌細(xì)胞EGFR-TKI抵抗的形成。為了明確這一假設(shè)，我們在GR模型中，外源性干擾了LINC00628的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞miR-145表達(dá)升高，且c-Myc及AKT1表達(dá)降低，同時細(xì)胞吉非替尼敏感性增強，這表明干擾LINC00628可能通過促進(jìn)miR-145的表達(dá)介導(dǎo)GR細(xì)胞吉非替尼抵抗的逆轉(zhuǎn)。另外，我們在GR模型中過表達(dá)miR-145后發(fā)現(xiàn)c-Myc及AKT1表達(dá)降低，與文獻(xiàn)中的結(jié)果趨勢一致[3,5]，且吉非替尼IC50下降，表明miR-145可抑制c-Myc及AKT1表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞對吉非替尼敏感，而在共轉(zhuǎn)染LINC00628及miR-145過表達(dá)載體后發(fā)現(xiàn)miR-145的效應(yīng)被LINC00628所拮抗，提示兩者可能存在調(diào)控作用。進(jìn)一步的熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，LINC00628與miR-145相互存在結(jié)合作用。值得一提的是，LINC00628已被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[14-17]，但本研究卻揭示了其在肺腺癌中的促癌價值，這可能是由于不同來源的惡性腫瘤中主導(dǎo)腫瘤進(jìn)展的分子機制不盡相同[18-19]，而LINC00628可能存在包括原癌及抑癌基因在內(nèi)的多種靶基因，導(dǎo)致其促癌作用及抑癌作用并存，而在肺腺癌中，其促癌作用顯著大于抑癌作用，因此產(chǎn)生了與乳腺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌及骨肉瘤中相反的生物學(xué)效應(yīng)，其確切機制仍有待進(jìn)一步探究。綜上，我們的研究發(fā)現(xiàn)LINC00628可通過結(jié)合miR-145，影響下游基因c-Myc、AKT1的表達(dá)及細(xì)胞吉非替尼抵抗能力，是潛在的肺腺癌治療靶點及分子標(biāo)志物。