侯 磊,安改麗,孫晶瑩,馮陽(yáng)蒙,霍雪萍,趙永麗

(1陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,西安 710068;2陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室;3陜西省康復(fù)醫(yī)院手術(shù)室;*通訊作者,E-mail:wrhouyijia2008@163.com)

肺癌死亡率在惡性腫瘤中位居第一,其中非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌類(lèi)型85%。吉非替尼(gefitinib,易瑞沙)、厄洛替尼片或阿法替尼等為代表的上皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epithelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)在具有EGFR突變的NSCLC中展現(xiàn)出了較高療效,因此,這些EGFR-TKI成為存在EGFR突變晚期NSCLC患者一線用藥選擇。然而,這些患者通常在服藥10個(gè)月左右都會(huì)產(chǎn)生耐藥,因此,克服或推遲耐藥能夠明顯促進(jìn)該類(lèi)患者預(yù)后。

目前普遍認(rèn)為,耐藥由多種因素導(dǎo)致,包括T790M繼發(fā)突變、轉(zhuǎn)化成小細(xì)胞肺癌、癌細(xì)胞干性獲得、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)等[1]。其中EMT在許多生理或病理過(guò)程中都會(huì)發(fā)生,主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性,上皮特性蛋白E-cadherin表達(dá)下降,間質(zhì)特性蛋白N-cadherin表達(dá)上升。EMT發(fā)生與多種腫瘤藥物耐藥相關(guān),因此,是克服耐藥一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)[2,3]。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是茶酚主要成分,占總量50%-75%,具有抗炎癥、預(yù)防腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病等多種生物活性[4-6]。此外,EGCG也被發(fā)現(xiàn)具有抑制EMT發(fā)生的作用,因此,EGCG是否具有逆轉(zhuǎn)或推遲EGFR-TKI耐藥作用需要被進(jìn)一步研究。本研究檢測(cè)了EGCG與吉非替尼作用于吉非替尼耐藥細(xì)胞株后,細(xì)胞周期、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)變化情況,旨在探討EGCG能否逆轉(zhuǎn)吉非替尼在EGFR突變陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌中的耐藥,及EMT是否發(fā)生了改變。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。吉非替尼購(gòu)于英國(guó)AstraZeneca公司。甲基偶氮唑鹽(MTT)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司。PRMI1640培養(yǎng)液、小牛血清購(gòu)于美國(guó)HyClone公司。兔抗人Caspase-3、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin抗體購(gòu)于武漢三鷹公司。Annexin Ⅴ/PI雙染凋亡試劑盒購(gòu)買(mǎi)于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。SDS-PAGE膠制備試劑盒與RNA酶(RNase)購(gòu)于陜西先鋒生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與吉非替尼耐藥株構(gòu)建

PC9細(xì)胞采用RPMI1640培養(yǎng)液(10%小牛血清+雙抗)在5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2-3 d傳代1次。使用半數(shù)致死劑量濃度吉非替尼持續(xù)培養(yǎng)PC9細(xì)胞至不再出現(xiàn)明顯死亡,逐漸增加吉非替尼濃度至1 μmol/L(吉非替尼有效血藥濃度為1 μmol/L),通過(guò)有限稀釋法單細(xì)胞種植于96孔板,繼續(xù)使用1 μmol/L吉非替尼培養(yǎng),將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的1孔細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),挑選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞轉(zhuǎn)至24孔板繼續(xù)生長(zhǎng),將其命名為PC9耐藥組,為實(shí)驗(yàn)所需耐藥株(吉非替尼溶解于DMSO中)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性

細(xì)胞以2×104/ml濃度接種于96孔板培養(yǎng)24 h,PC9細(xì)胞分別使用0.01,0.02,0.04,0.08,0.16 μmol/L吉非替尼處理,計(jì)算IC50。PC9耐藥細(xì)胞分別使用0.8,1,2,4,8,16 μmol/L吉非替尼處理,計(jì)算耐藥組IC50。為篩選對(duì)PC9耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響的EGCG劑量,PC9耐藥細(xì)胞分別使用5,10,20,40,100,200 μmol/L的EGCG處理。各組培養(yǎng)44 h,毎孔中加入MTT 20μl(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄掉培養(yǎng)液后加入200 μl DMSO,酶標(biāo)儀讀取490 nm吸光值,計(jì)算細(xì)胞增殖率,計(jì)算半數(shù)抑制率(IC50,GraphpadPrism 5.0)。

1.4 細(xì)胞分組及處理

PC9耐藥組細(xì)胞分別用吉非替尼(1 μmol/L)、EGGC(5 μmol/L)、1 μmol/L吉非替尼+5 μmol/LEGGC孵育48 h后,分別命名為吉非替尼組、EGCG組和吉非替尼+EGCG組。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞使用胰酶制成懸液，使用70%的冰乙醇4 ℃固定24 h，細(xì)胞離心棄除乙醇，加入RnaseA，37 ℃水浴30 min，加入PI 50 μl，4 ℃避光30 min，選擇488 nm波長(zhǎng)檢測(cè)DNA含量，使用細(xì)胞周期擬合軟件分析各周期細(xì)胞百分比。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

使用胰酶消化制成細(xì)胞懸液,PBS重新懸浮離心細(xì)胞2次,加入500 μl 1×Binding Buffer、5 μl Annexin Ⅴ-FITC、10 μl PI,混勻室溫下避光15 min,上機(jī)檢測(cè),以不加Annexin Ⅴ-FITC及PI細(xì)胞懸液作為陰性對(duì)照。

1.7 Western blot檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2、E-cadherin和N-cadherin表達(dá)

細(xì)胞使用蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定濃度。同劑量蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，TBST(5%脫脂奶粉)封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3(1 ∶1 000)和Bcl-2(1 ∶1 000)與EMT相關(guān)蛋白E-cadherin(1 ∶800)和N-cadherin(1 ∶800)，二抗室溫孵育1 h，加入ECL顯色底物，使用Image-ProPlus軟件分析灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性檢測(cè)與耐藥株構(gòu)建

MTT法檢測(cè)結(jié)果提示吉非替尼針對(duì)PC9細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為劑量依賴性(見(jiàn)圖1),IC50為0.031 μmol/L。吉非替尼對(duì)PC9耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)抑制也呈劑量依賴性(見(jiàn)圖1),IC50為5.93 μmol/L,表明PC9耐藥細(xì)胞較PC9細(xì)胞針對(duì)吉非替尼具有明顯抵抗性。EGCG在濃度大于20 μmol/L時(shí),對(duì)PC9耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始出現(xiàn)抑制現(xiàn)象(見(jiàn)圖1),而后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要一個(gè)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響的條件,因此選擇了5 μmol/L作為后續(xù)研究EGCG濃度。隨后在該條件基礎(chǔ)上再次對(duì)PC9耐藥組細(xì)胞進(jìn)行吉非替尼細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)吉非替尼針對(duì)PC9耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)抑制能力明顯增強(qiáng),IC50降至3.86 μmol/L(見(jiàn)圖1)。

與吉非替尼組比較,*P<0.05圖1 MTT檢測(cè)吉非替尼和EGCG作用48 h對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Figure 1 Effect of gefitinib and EGCG on cell growth at 48 h by MTT

2.2 EGCG增加了吉非替尼對(duì)耐藥細(xì)胞周期阻滯

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,結(jié)果顯示:PC9耐藥組、吉非替尼組、EGCG組及吉非替尼+EGCG組G2/M期細(xì)胞比例分別為(10.8±1.2)%,(9.5±2.0)%,(12.3±2.1)%和(38.0±3.0)%(見(jiàn)圖2)。PC9耐藥組、吉非替尼組和EGCG組間G2/M期細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),吉非替尼+EGCG組相比于其他三組,G2/M期細(xì)胞比例增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,EGCG聯(lián)合吉非替尼能夠?qū)⒛退幖?xì)胞周期阻滯于G2/M期。

與其他三組比較,*P<0.05圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)吉非替尼與EGCG對(duì)PC9耐藥細(xì)胞周期影響 (n=3)Figure 2 Effect of gefitinib and EGCG on the cell cycle of gefitinib-resistant PC9 cells by flow cytometry (n=3)

2.3 EGCG促進(jìn)了吉非替尼對(duì)耐藥細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)

通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡變化,結(jié)果顯示:PC9耐藥組、吉非替尼組、EGCG組及吉非替尼+EGCG組細(xì)胞凋亡率分別為(8.2%±1.3)%,(10.0±1.3)%,(8.1±0.9)%,(21.6±2.7)%(見(jiàn)圖3)。相較于PC9耐藥組、吉非替尼組、EGCG組,吉非替尼+EGCG組細(xì)胞凋亡率明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PC9耐藥組、吉非替尼組和EGCG組之間細(xì)胞凋亡率并無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)果表明,EGCG的使用提高了吉非替尼對(duì)于耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的能力。

與其他三組比較,*P<0.05圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)吉非替尼與EGCG對(duì)PC9耐藥細(xì)胞凋亡的影響 (n=3)Figure 3 Effect of gefitinib and EGCG on the apoptosis of gefitinib-resistant PC9 cells by flow cytometry (n=3)

2.4 EGCG提高了吉非替尼對(duì)耐藥細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

使用Wester blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bcl-2表達(dá)變化,結(jié)果提示:相較于PC9耐藥組、吉非替尼組和EGCG組,吉非替尼+EGCG組細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量明顯增多,Bcl-2表達(dá)明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖4)。PC9耐藥組、吉非替尼組、EGCG組間Caspase-3和Bcl-2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明EGCG使用能夠明顯促進(jìn)吉非替尼對(duì)耐藥細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)的誘導(dǎo)和Bcl-2表達(dá)的抑制。

與其他三組比較,*P<0.05圖4 Western blot檢測(cè)吉非替尼與EGCG對(duì)PC9耐藥細(xì)胞Caspase-3與Bcl-2表達(dá)的影響 (n=3)Figure 4 Effect of gefitinib and EGCG on expression of Caspase-3 and Bcl-2 in gefitinib-resistant PC9 cells by Western blot (n=3)

2.5 EGCG逆轉(zhuǎn)吉非替尼誘導(dǎo)的EMT相關(guān)蛋白改變

使用Western-blot檢測(cè)PC9組、PC9耐藥組、EGCG組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin與N-cadherin表達(dá)變化,結(jié)果顯示,與PC9組比較,PC9耐藥組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少,N-cadherin蛋白表達(dá)明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與PC9耐藥組相比,EGCG組E-cadherin蛋白表達(dá)增多,N-cadherin蛋白表達(dá)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖5)。結(jié)果表明,吉非替尼的耐藥與其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān),而EGCG能夠抑制這種轉(zhuǎn)化。

與PC9組和EGCG組比較,*P<0.05圖5 Western blot檢測(cè)吉非替尼與EGCG對(duì)PC9細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白影響 (n=3)Figure 5 Effect of gefitinib and EGCG on expression of EMT-related proteins in PC9 cells by Western blot (n=3)

3 討論

EGFR常見(jiàn)突變的NSCLC對(duì)于EGFR-TKI具有較好反應(yīng),但隨時(shí)間延長(zhǎng),耐藥變?yōu)椴豢杀苊狻Ｒ虼?必須尋找一種方法來(lái)延緩或克服耐藥發(fā)生。一種思路是聯(lián)合一種藥物去克服或推遲耐藥。有研究使用NAC聯(lián)合吉非替尼,發(fā)現(xiàn)能夠有效克服耐藥[7]。還有使用Decitabine,一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥[8]。本研究挑選了EGCG,結(jié)果表明同樣具有克服吉非替尼耐藥作用。

EGCG是綠茶中多酚的主要成分,擁有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等特性,并對(duì)腫瘤病人相對(duì)安全[9,10]。本研究使用PC9細(xì)胞株,EGFR19外顯子缺失突變的肺腺癌細(xì)胞株。構(gòu)建了針對(duì)吉非替尼耐藥細(xì)胞株,通過(guò)MTT法分析吉非替尼IC50,結(jié)果表明PC9耐藥組的IC50較PC9組的IC50提高了100多倍,表明構(gòu)建耐藥細(xì)胞的確對(duì)吉非替尼產(chǎn)生了耐藥。為了研究EGCG是否能夠逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥,挑選了一個(gè)針對(duì)PC9耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響的條件,在此基礎(chǔ)上,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)再次檢測(cè)吉非替尼對(duì)PC9耐藥細(xì)胞影響,結(jié)果表明IC50下降。同時(shí),通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了EGCG的使用是否改變了吉非替尼對(duì)PC9耐藥細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響,結(jié)果表明,EGCG的聯(lián)合能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯于G2/M期,同時(shí)EGCG的聯(lián)合能夠明顯提高吉非替尼對(duì)凋亡的誘導(dǎo)。Western blot結(jié)果也表明,EGCG能夠提高吉非替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。這些研究進(jìn)一步表明EGCG能夠逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥,使得吉非替尼耐藥細(xì)胞再次對(duì)吉非替尼發(fā)生反應(yīng)。這與Meng等[11]研究結(jié)果相似,但他們研究主要集中在ERK信號(hào)通路上。EGCG是一個(gè)泛靶點(diǎn)藥物,除了該條通路是否還存在其他機(jī)制來(lái)逆轉(zhuǎn)耐藥。

目前吉非替尼耐藥機(jī)制主要包括:1.經(jīng)典耐藥機(jī)制,EGFR基因二次突變和c-MET擴(kuò)增;2.代償信號(hào)通路的建立和調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的改變,如IL-6/JAK1/STAT3信號(hào)通路激活、IGF1R介導(dǎo)的信號(hào)通路激活、Kras基因突變等;3.EMT發(fā)生轉(zhuǎn)換[12,13]。研究表明,EGCG在腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞都具有較強(qiáng)的EMT抑制作用。在甲狀腺癌細(xì)胞中,EGCG能夠通過(guò)抑制TGF-β1/Smad通路抑制EMT發(fā)生[14],在干細(xì)胞中,EGCG也能夠抑制EMT發(fā)生[15]。因此,考慮EGCG對(duì)于吉非替尼耐藥逆轉(zhuǎn),是否可能通過(guò)對(duì)EMT影響而實(shí)現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PC9細(xì)胞和PC9耐藥細(xì)胞相比,E-cadherin蛋白表達(dá)下降,N-cadherin蛋白表達(dá)上升,表明吉非替尼耐藥的確與腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生相關(guān)。而EGCG下調(diào)PC9耐藥細(xì)胞N-cadherin蛋白表達(dá),上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)。表明EGCG能夠逆轉(zhuǎn)耐藥PC9細(xì)胞EMT。因此,EGCG對(duì)EMT影響是其逆轉(zhuǎn)PC9對(duì)吉非替尼耐藥機(jī)制之一。雖然研究結(jié)果顯示,EGCG只是將吉非替尼IC50降到了3.86 μmol/L,并沒(méi)有降至1 μmol/L之下,但由于使用的EGCG只是一個(gè)最低劑量,且EGCG對(duì)PC9耐藥細(xì)胞也呈現(xiàn)一個(gè)劑量依賴性細(xì)胞毒性,因此,理論上能夠通過(guò)提高EGCG劑量來(lái)增加協(xié)同效果,這需進(jìn)一步研究。

綜上所述,EGCG能夠逆轉(zhuǎn)存在EGFR突變肺腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI耐藥,抑制EMT發(fā)生是逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制之一。吉非替尼耐藥機(jī)制較多,本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞除EMT機(jī)制外,是否還存在其他耐藥機(jī)制,且EGCG為多靶點(diǎn)藥物,是否還存在其他逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制需要我們進(jìn)一步研究。