李曉丹 原翔 劉怡文 李治岐 萬里新

肺腺癌(lung adenocarcinoma cancer，LAC)是非小細(xì)胞肺癌的常見病理組織學(xué)類型之一，[1-3]患者預(yù)后較差，臨床五年生存率在10%～15%[4]。鱗狀細(xì)胞癌擴(kuò)增基因1(Gene Amplified in Squamous Cell carcinoma 1,GASC1)，也稱KDM4C， 在食管癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤及髓母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中都有高頻擴(kuò)增或異常高表達(dá)，并且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，表現(xiàn)為導(dǎo)致細(xì)胞永生化，增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲性，與不良預(yù)后相關(guān)[5-9]然而目前尚沒有研究評估GASC1作為生物指標(biāo)與肺腺癌預(yù)后之間的關(guān)系，因此本研究擬通過分析100例肺腺癌組織GASC1的表達(dá)情況，評估其臨床意義及預(yù)后價值，為臨床肺腺癌的診療提供新的思路。

資料與方法

一、研究對象及標(biāo)本

100例肺腺癌組織標(biāo)本，均來自2016年1月至2016年11月南陽市中心醫(yī)院胸外科接受手術(shù)治療的肺腺癌患者。其中男53例，女47例；<60歲37例，≥60歲63例；有吸煙史36例，無吸煙史64例；高分化、中分化和低分化分別有28、56與16例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例，無轉(zhuǎn)移者63例；TNM分期為Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ期者分別有63例與37例?；颊呔鶠槌醮谓邮苤委?。該項目經(jīng)過南陽市中心醫(yī)院倫理委員會的同意，并于術(shù)前獲得患者書面知情同意。

二、免疫組化

組織蠟塊切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水，檸檬酸鹽修復(fù)液微波加熱修復(fù)，免疫組化S-P超敏試劑盒(美國R&D公司)檢測標(biāo)本組織GASC1(抗鼠單克隆抗體1 ∶200，abcam)表達(dá)，室溫孵育、PBS沖洗，蘇朩素復(fù)染、酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。GASC1為胞核和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。隨機(jī)挑選5個高倍鏡視野，根據(jù)染色強(qiáng)度(0分，淺黃色；1分，棕黃色；2分，棕褐色；3分，深褐色)和陽性細(xì)胞百分比(0分，≥0%且<5%；1分，≥5%且<25%；2分，≥25%且<50%；3分，≥50%且<75%；4分≥75%)的乘積對每個視野進(jìn)行免疫組化綜合評分：0分為陰性；1～12為陽性，5個視野免疫組化評分均值為最終結(jié)果。

三、GASC1 mRNA檢測

用液氮將肺腺癌及癌旁組織標(biāo)本冷凍后，用石臼研磨呈粉末狀，用Trizol法提取RNA，后將1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)試劑盒(北京鼎國)步驟合成cDNA，根據(jù)Q-PCR(諾唯贊)試劑盒步驟檢測GASC1 mRNA相對表達(dá)量。GASC1引物序列為：上游5′-TGGATCCCAGATAGCAATGA-3′，下游5′-TGTCTTCAAATCGCATGTCA-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列為：上游5′-GCCACATCGCTCAGACACC-3′，下游 5′-GATGGCAACAATATCCACTTTACC-3′。GSK3β和GAPDH退火溫度均為60℃，經(jīng)40個循環(huán)擴(kuò)增，計算方法為2(-ΔΔCt)。

四、Western blot檢測

用液氮將肺腺癌及癌旁組織標(biāo)本冷凍后，用石臼研磨呈粉末狀，用12% SDS-聚丙酰胺凝膠進(jìn)行蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉PVDF膜(密理博)1h，加用TBST稀釋的一抗(GASC1, 1 ∶300； GAPDH，1 ∶2 000，世紀(jì)康維)4℃過夜，震蕩洗膜，加入二抗標(biāo)記(1 ∶3 000，世紀(jì)康維)室溫孵育2 h，使用ECL(美國Invitrogen)顯影劑處理PVDF膜，置于凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD)，檢測目的蛋白條帶，應(yīng)用ImageLab軟件計算目的蛋白表達(dá)水平。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、肺腺癌中GASC1蛋白的表達(dá)

本研究對肺腺癌及癌旁組織進(jìn)行了蛋白及mRNA相對表達(dá)量的檢測，結(jié)果顯示肺腺癌組織GASC1蛋白及mRNA相對表達(dá)量顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(見圖1、表1)。

圖1 Western blot檢測肺腺癌及相應(yīng)癌旁組織中GASC1蛋白表達(dá)

二、免疫組化法檢測GASC1蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示GASC1蛋白為棕黃色及棕褐色顆粒，主要位于肺腺癌細(xì)胞胞核，部分胞漿也有表達(dá)(圖1)；且隨著分化程度的降低(A：高分化；B：中分化；C：低分化)，免疫組化評分逐漸升高(見圖2)。

圖2 免疫組化檢測肺腺癌組織中GASC1表達(dá)(400×)

圖3 生存曲線

三、GASC1表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

研究對GASC1蛋白相對表達(dá)量與肺腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GASC1蛋白與分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及生存顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與性別、年齡、和吸煙無顯著相關(guān)性(P>0.05)(見表2)。

表2 GASC1蛋白表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

四、GASC1蛋白表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后

研究對100例術(shù)后肺腺癌患者進(jìn)行隨訪，應(yīng)用Kaplan-Meier繪制生存曲線并以Log-rank檢驗生存時間之間差異，患者術(shù)后隨訪時間36個月，生存時間為入院時間至最后一次隨訪日期或死亡，刪失數(shù)據(jù)為隨訪至36個月仍存活的患者，未刪失數(shù)據(jù)為由肺腺癌導(dǎo)致的死亡患者。結(jié)果顯示，肺腺癌患者術(shù)后3年的總生存率為53.00%(圖3)；GASC1陽性表達(dá)組3年生存率(33.33%)顯著低于GASC1陰性組的3年生存率(67.24%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.62，P<0.01)；GASC1陽性表達(dá)組的平均生存時間(21.55±2.10)顯著低于GASC1陰性組(30.55±1.27)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.63，P<0.001)(圖3)。

討 論

本研究是一項針對GASC1在肺腺癌預(yù)后中作用的大型前瞻性研究(肺腺癌標(biāo)本共計100例)。研究結(jié)果顯示，GASC1陽性患者的預(yù)后較差，并且與肺腺癌分期及術(shù)后癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，可以作為預(yù)后獨(dú)立因素預(yù)測患者術(shù)后的生存質(zhì)量。

本研究通過免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)GASC1在肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核高表達(dá)，為棕黃色及棕褐色顆粒，進(jìn)一步檢測其蛋白及mRNA的表達(dá)水平，均發(fā)現(xiàn)相比癌旁組織GASC1在肺腺癌組織中高表達(dá)，且與肺腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)GASC1可通過H3K9去甲基化作用促進(jìn)原癌基因NOTCHl、OCT4、NANOG等的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞增殖[5, 11-12]。GASC1可與缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1a)結(jié)合，降低HIF-la的靶基因位點H3K9me3的表達(dá)水平，進(jìn)而活化其下游靶基因，促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[13]。此外，Luo等人在小鼠乳腺脂肪墊中注射MDA-MB-435癌細(xì)胞，對比GASC1基因正常組小鼠發(fā)現(xiàn)基因敲除組小鼠乳腺癌的進(jìn)展被抑制。以上研究結(jié)果均表明GASC1可以調(diào)節(jié)組蛋白甲基化狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)控癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移。

研究結(jié)果顯示GASC1陽性患者的三年生存率顯著低于GASC1陰性患者，提示GASC1可作為肺腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子，提示GASC1的高表達(dá)在肺腺癌中可以作為一個獨(dú)立預(yù)后因子，評估患者術(shù)后的生存情況。與本研究結(jié)果類似，李娜等在食管癌的研究中發(fā)現(xiàn)GASC1陽性表達(dá)的食管鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后2年生存率為65.8%，而陰性表達(dá)者為86.4%，GASC1陽性患者的術(shù)后2年生存率顯著低于GASC1陰性患者[14]。Liu等發(fā)現(xiàn)GASC1基因在乳腺上皮MCF10A細(xì)胞系中 9p23-24 區(qū)域擴(kuò)增明顯，誘導(dǎo)細(xì)胞永生化改變，使正常乳腺上皮細(xì)胞不依賴生長因子進(jìn)行增殖，可作為參與干細(xì)自我更新的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)MCF10A細(xì)胞系形成乳腺球結(jié)構(gòu)，增加了乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致癌變的發(fā)生[5]， 但Berdel 等在乳腺癌患者中卻發(fā)現(xiàn)GASC1陽性患者的乳腺癌復(fù)發(fā)時間比GASC1陰性患者晚兩年，且與更好的預(yù)后相關(guān)，對放射和激素治療具有更好的敏感性[15]。這些研究結(jié)果提示我們下一步應(yīng)繼續(xù)研究GASC1介導(dǎo)肺腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，明確GASC1蛋白在誘導(dǎo)肺腺癌侵襲發(fā)展中的作用。

綜上所述，本研究顯示GASC1陽性與肺腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和生存顯著相關(guān)，GASC1高表達(dá)可能促進(jìn)了肺腺癌發(fā)生發(fā)展的過程，可能是肺腺癌靶向治療的潛在分子靶點之一。