吳雅廷，劉海亮,2

(1.石河子大學生命科學學院新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832003；2.同濟大學附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學研究所，上海 200123)

柚皮素是一種黃酮類化合物，主要存在于柑橘類的水果中[1-2]，國內(nèi)外研究表明柚皮素具有抗氧化[3]、抗癌[4]、抗衰老[5]、神經(jīng)保護[6]等多種生物活性功能。研究發(fā)現(xiàn)柚皮素對多種細胞的活力有一定的調(diào)控作用，例如對血管內(nèi)皮細胞活力具有明顯的促進作用[7]；對神經(jīng)小膠質(zhì)細胞的增殖具有一定的促進作用[8]，并且能夠抑制神經(jīng)細胞凋亡[9]。相關(guān)研究提出柚皮素對脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cell,ADSC)中相關(guān)基因的表達具有一定的調(diào)控作用[10-11]，因此探究柚皮素對脂肪間充質(zhì)干細胞細胞活力是否具有一定的影響具有一定的研究意義。

ADSC因其具有自我更新速度快、能夠穩(wěn)定增殖、具備多項分化潛能的特點[12]，作為臨床上較為理想的干細胞治療的細胞來源[13]，有關(guān)其維持細胞干性功能的研究具有非常重要的意義[14-15]。

本實驗通過柚皮素對體外培養(yǎng)的ADSC的干預作用探究其對ADSC增殖情況的影響。該實驗過程中通過探究柚皮素對ADSC的細胞周期及與ADSC增殖相關(guān)的P16ink4a的蛋白表達情況、活性氧類(ROS)含量、細胞衰老狀況的影響，了解了柚皮素對ADSC增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

成人脂肪間充質(zhì)干細胞來源于同濟大學表觀遺傳學實驗室，細胞鑒定工作在實驗室前期相關(guān)實驗中已經(jīng)完成[16]。

DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清溝自于美國Gibco公司。柚皮素(HPLC>98%)購自于北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司。CCK-8試劑盒、細胞周期試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自于碧云天生物技術(shù)有限公司、P16ink4a-抗體及兔抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與藥物處理 ADSC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱。當細胞濃度達到80%～90%時，用0.25%Trypsin EDTA消化細胞，按照1∶3的比例對細胞進行傳代培養(yǎng)。按照作用于細胞的柚皮素濃度不同，以低濃度(6.25μmol/L)、中間濃度(25μmol/L)、高濃度(100μmol/L)的濃度梯度加入96孔板處理細胞24h，其中對照組以等體積的PBS取代柚皮素對細胞進行干預。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期的細胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)置5個復孔，貼壁培養(yǎng)過夜后柚皮素干預24h和48h后，每孔加10μL CCK-8溶液并使其混合均勻。使用酶標儀在450nm波長處檢測吸光值。該實驗進行3次以上統(tǒng)計分析。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 收集對數(shù)生長期的細胞以1×104/孔接種于6孔板，每組設(shè)置3個復孔，貼壁培養(yǎng)過夜后柚皮素干預24h后，終止培養(yǎng)，用0.25%Trypsin EDTA消化細胞，離心(離心半徑13.5cm，1000r/min,5min)并棄上清液，預冷PBS洗滌細胞3次。用預冷的70%無水乙醇固定過夜，再加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液200μL，避光染色 30min，用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測染色結(jié)果，用FlowJo軟件分析細胞周期。該實驗進行3次以上統(tǒng)計分析。

1.2.4 Western印跡法檢測P16ink4a的表達水平 收集對數(shù)生長期的細胞以1×104/孔接種于6孔板，每組設(shè)置3個復孔，貼壁培養(yǎng)過夜后柚皮素干預24h后，終止培養(yǎng)吸去上清加入無酶RIPA細胞裂解液置于冰上裂解10min，4℃離心(離心半徑13.5cm，12000r/min，10min)收集蛋白，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定hADSC蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度保持一致加蛋白上樣緩沖液混勻并煮沸。進行SDS-PAGE電泳(120V，60min)，根據(jù)三色預染蛋白marker和P16ink4a蛋白大小進行切膠，按照轉(zhuǎn)膜的“三明治”結(jié)構(gòu)進行轉(zhuǎn)膜(60V，80min)，封閉液室溫封閉1h，加P16ink4a抗體按1∶1000稀釋好后4℃孵育過夜并洗去多余的一抗，再用兔抗體(1∶10000)孵育2h。利用化學發(fā)光法檢測蛋白表達情況，利用雅酶試劑盒將發(fā)光液(A液∶B液=1∶1)加到PVDF膜上，孵育3min。吸去多余的液體在化學發(fā)光成像系統(tǒng)(ImageQuant LAS)進行灰度分析。該實驗進行3次以上統(tǒng)計分析。

1.2.5 β-半乳糖苷酶染色 收集對數(shù)生長期的p16代次的細胞以5×103/孔接種于12孔板，每組設(shè)置3個復孔，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)過夜后，用含柚皮素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24h后，無菌PBS洗滌12孔板中貼壁細胞3次，每孔加入4%多聚甲醛細胞固定液100μL室溫固定細胞30min并吸去固定液，用PBS沖洗2遍。用細胞β-半乳糖苷酶染色試劑盒進行染色，每孔加染色液100μL(A液1%、B液1%、C液93%、X-Gal染液5%)，37℃培養(yǎng)箱避光染色過夜，PBS沖洗2遍，用DAPI(0.1%)染色液染核，PBS沖洗2遍，每孔再加500μL無菌PBS使細胞保持濕潤，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞染色結(jié)果，觀察過程中選取5個規(guī)定區(qū)域，對每個區(qū)域總細胞進行計數(shù)和染色細胞計數(shù)取平均值。該實驗進行3次以上統(tǒng)計分析。

1.2.6 細胞內(nèi)ROS檢測 收集對數(shù)生長期的細胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)置5個復孔，在37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)過夜后柚皮素干預24h后，再加入ROS檢測試劑5μL避光繼續(xù)培養(yǎng)30min。使用iD3酶標儀在480、525nm 處檢測吸光值分析ADSC內(nèi)ROS含量。

1.2.7 mRNA測序 6孔板培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細胞，濃度為25μmol/L柚皮素處理細胞24h后吸去培養(yǎng)基，用PBS沖洗2～3次，加入一定量TRIzol(美國Invitrogen公司)裂解細胞并提取總RNA，并用分光光度計(美國Thermo公司)對總RNA進行定量。對符合質(zhì)量標準(A260/A280>1.8)的樣品進行測序。數(shù)據(jù)分析基于高通量測序結(jié)果，建立參照基因組索引:Bowtie v2.0.6(bowtie-bio.source-forge.net/bowtie2)計算每個樣本的基因表達水平。差異基因表達通過熱圖和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes;https:∥www.genome.jp/kegg)進行分析。KEGG分析時，P<0.05作為判斷基因顯著富集的閾值。測序數(shù)據(jù)可以根據(jù)需要聯(lián)系通信作者，予以提供。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 柚皮素對ADSC增殖的影響

不同濃度柚皮素干預24、48h后ADSC的細胞活性檢測結(jié)果如圖1所示，當不同濃度柚皮素干預24h后，與對照組相比，當柚皮素在低濃度(6.25μmol/L) 時增殖率為95.8%，與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義，在中間濃度(25μmol/L)時明顯促進了細胞的增殖(P<0.01)，細胞的增殖速率為120.3%；在高濃度(100μmol/L) 時增殖率為51.6%(P<0.01)，對細胞增殖具有明顯的抑制的作用。干預48h后細胞活力檢測結(jié)果如圖1所示，在低濃度(6.25μmol/L)時增殖率為97.9%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；在中間濃度(25μmol/L)時增殖率為114.6%與對照組相比具有明顯的促進作用(P<0.05)，在高濃度(100μmol/L)時增殖率為48%(P<0.01)，對細胞增殖具有明顯的抑制作用。柚皮素干預細胞24、48h后，檢測結(jié)果均表現(xiàn)出濃度為25μmol/L時對細胞增殖具有明顯的促進作用，而在低濃度 (6.25μmol/L) 時對細胞增殖無明顯的促進作用，在高濃度(100μmol/L)時對細胞的增殖具有明顯的抑制作用。

圖1 不同濃度柚皮素干預下ADSC的增殖情況Fig.1 Effects of different concentrations of naringenin on cell proliferation*P<0.05，**P<0.01；ns:差異無統(tǒng)計學意義

2.2 柚皮素對ADSC細胞周期的影響

根據(jù)2.1的結(jié)果，即柚皮素濃度為25μmol/L時促進了細胞的增殖，進一步檢測了不同濃度對ADSC細胞周期的影響。藥物干預后細胞周期變化情況如圖2所示，流式細胞術(shù)結(jié)果表明，當柚皮素濃度為 25μmol/L 干預細胞后，與對照組相比，G1期細胞比例減少，快速進入S期，S期細胞比例增加，G2/M期細胞所占比例差異無統(tǒng)計學意義。細胞流式數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果表明，柚皮素濃度為25μmol/L時，在G0/G1期細胞所占比例明顯低于對照組(P<0.05)，S期細胞所占比例明顯高于對照組，G2/M差異無統(tǒng)計學意義。同時從圖中可以看出，當柚皮素濃度為6.25、100μmol/L時對細胞周期無明顯影響。

圖2 柚皮素對ADSC細胞周期的影響Fig.2 Effect of naringenin on cell cycle of ADSC*P<0.05；不同濃度均含2個重復樣品

2.3 柚皮素對P16ink4a的表達水平的影響

P16ink4a的表達對細胞周期具有一定的影響，因此進一步通過Western印跡法對P16ink4a蛋白在細胞中的表達情況進行了檢測。實驗結(jié)果表明濃度當濃度為25μmol/L時的柚皮素干預24h后，與對照組相比P16ink4a的蛋白明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖3。

圖3 柚皮素干預后P16ink4a的蛋白表達水平的變化Fig.3 Changes of the P16ink4a expression of ADSC following exposure to naringenin*P<0.05

2.4 柚皮素對細胞衰老的影響

通過β-半乳糖苷酶染色檢測柚皮素對細胞衰老情況的影響。選取衰老代次細胞(p16代)并用柚皮素處理細胞24h后觀察細胞衰老的結(jié)果。β-半乳糖苷酶染色實驗結(jié)果如圖4所示，實驗組衰老的細胞明顯少于對照組在正常情況下衰老的細胞，3次染色統(tǒng)計結(jié)果對照組與實驗組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，該結(jié)果進一步表明柚皮素能夠促進hADSC增殖而抑制其衰老。

圖4 柚皮素對衰老細胞的影響Fig.4 Effect of naringenin on the aging of ADSC**P<0.01

2.5 柚皮素對細胞內(nèi)活性氧含量的影響

氧化應激對細胞的增殖具有重要的影響，其中細胞內(nèi)ROS含量的變化是一個非常重要的檢測指標。柚皮素干預24h后，ADSC細胞內(nèi)ROS含量受到了影響，與對照組相比當柚皮素濃度為25μmol/L 時抑制了細胞內(nèi)ROS含量的增加(下降到70%，P<0.01)。

2.6 mRNA測序結(jié)果分析

根據(jù)2.1～2.5實驗結(jié)果，對柚皮素干預后的ADSC進行了mRNA測序。當柚皮素濃度為25μmol/L 時處理ADSC后與對照組相比較有933個差異表達的基因，其中表達上調(diào)的基因有288個，表達下調(diào)的基因有645個。KEGG信號通路富集分析結(jié)果如圖5A所示，結(jié)果顯示核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體信號通路、吞噬小體、蛋白多糖及礦物吸收受到明顯的調(diào)控。其中結(jié)瘤樣受體信號通路對細胞增殖具有一定的調(diào)控作用[17-18]，基因集富集分析結(jié)果如圖5B所示，基因集標準富集得分NES值為2.37(P=0.003)，基因集成員顯著聚集在頂部，表明柚皮素處理對該信號通路中基因基因富集情況有明顯影響；并對受該信號通路調(diào)控的基因通過熱圖進行了差異表達分析，結(jié)果如圖5C所示，當柚皮素濃度為25μmol/L時處理ADSC后與對照組相比較，DPP4、STAT1、SFRP4、SOD2的表達量被上調(diào)了，其中SOD2的表達上調(diào)受到ROS含量降低的調(diào)控[19-20]，因此SOD2上調(diào)與2.5實驗結(jié)果相一致。

圖5 mRNA測序結(jié)果分析Fig.5 Analysis of RNA-seq resultA：信號通路富集氣泡圖；B：基因集富集圖；C：差異基因表達熱圖

3 討 論

本研究通過檢測不同濃度的柚皮素對體外培養(yǎng)的ADSC干預24h(P<0.01)和48h(P<0.05)后在濃度為25μmol/L時均能夠明顯促進ADSC增殖，而在低濃度6.25μmol/L時對細胞的增殖無明顯影響，在高濃度100μmol/L時對細胞的增殖具有明顯抑制作用。同時可以發(fā)現(xiàn)干預24h的增殖速率高于 48h，這一趨勢與相關(guān)研究中提出的隨著柚皮素干預時間的增加，相對應地，對細胞的作用效果逐漸減弱[21]的規(guī)律相一致，與此同時也可能與細胞對柚皮素的吸收效率[22]及對細胞的最佳作用時間[23]有密切聯(lián)系。

接下來探究了不同濃度柚皮素對細胞周期的影響，結(jié)果表明柚皮素對ADSC細胞周期有一定的影響，當柚皮素濃度為25μmol/L時能夠促進細胞周期快速從G0/G1期快速進入S期(P<0.05)，即顯著促進細胞進入增殖期使細胞快速增殖。癌基因P16ink4a與hADSC的增殖密切相關(guān)，阻斷P16ink4a基因的表達有助于改善生理性衰老對干細胞功能的抑制，P16ink4a基因在細胞中的表達情況在一定程度上能夠反映出ADSC是否存在增殖停滯或增殖緩慢[24]。因此，在接下來的實驗中對P16ink4a蛋白表達情況進行了檢測，檢測結(jié)果表明，與對照組相比柚皮素干預后P16ink4a蛋白表達量明顯下調(diào)(P<0.05)。P16ink4a蛋白的表達情況與細胞的衰老狀況緊密相關(guān)[25-26]，因此對柚皮素干預后細胞的衰老狀況進行了檢測，實驗結(jié)果表明柚皮素對ADSC的衰老具有明顯的抑制作用(P<0.01)，這也進一步證明柚皮素對ADSC的增殖有一定的促進作用。同時有研究表明抑制細胞衰老對細胞增殖具有一定的促進作用[27]，其重要原因表現(xiàn)在細胞衰老是由于細胞周期阻滯使細胞增殖速度變慢[28]、P16ink4a基因的高表達等因素促進了細胞的衰老使細胞增殖活性降低[29]。因此，該實驗結(jié)果對細胞衰老與細胞增殖之間的關(guān)系進行了驗證。

另外，氧化應激對細胞的增殖也具有十分重要的調(diào)節(jié)作用，過度的氧化應激對ADSC的增殖具有明顯抑制作用[30]，ROS含量升高則會引起細胞功能障礙，導致細胞衰老[31]。進一步對細胞內(nèi)ROS水平進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，柚皮素干預后細胞內(nèi)ROS水平明顯降低(P<0.05)，即柚皮素能夠降低氧化應激對細胞帶來的損傷。

以上實驗結(jié)果表明柚皮素通過促進細胞周期從G0/G1期進入S期、下調(diào)P16ink4a基因的表達、抑制β-半乳糖苷酶含量的升高及下調(diào)細胞內(nèi)ROS含量促進了ADSC的增殖。mRNA測序結(jié)果表明柚皮素干預ADSC后核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體信號通路受到明顯的調(diào)控，相關(guān)研究表明該信號通路對細胞的增殖具有一定的調(diào)控作用[32-33]。并且進一步發(fā)現(xiàn)該信號通路能夠激活SOD2基因表達，SOD2的表達受ROS的調(diào)控，ROS含量降低能夠激活SOD2表達[34-35]。因此與前面結(jié)果中柚皮素能夠促進ROS水平降低的結(jié)果相一致。測序結(jié)果表明，柚皮素能夠通過激活核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體信號通路上調(diào)SOD2基因的表達，從而促進ADSC的增殖。

干細胞因其具有自我更新速度快、能夠穩(wěn)定增殖、具有多向分化潛能的特點，已被廣泛應用于多種退行性疾病治療的研究當中。尤其是ADSC在干細胞治療領(lǐng)域具有極為廣泛的研究，例如對脊髓損傷[36]、腦中卒[37]等疾病具有較為明顯的治療效果，另外，與其他來源的間充質(zhì)干細胞相比較，ADSC來源較為廣泛且取材比較容易[38]，自體來源可避免發(fā)生免疫排斥，因此可作為臨床上較為理想的干細胞治療的細胞來源。但是，近年來研究發(fā)現(xiàn)ADSC在體外傳代培養(yǎng)的過程中隨著傳代次數(shù)增加細胞有衰老的傾向[39]，同時在體內(nèi)也會隨著個體的衰老出現(xiàn)功能的衰退[40]，因此維持細胞干性功能的研究具有非常重要的意義[41]。

近年來，關(guān)于天然小分子化合物生物活性的研究越來越廣泛，其中柚皮素作為一種研究較為廣泛的小分子化合物，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤[42]、心臟保護[43]、抗氧化[44]、抗炎[45]等多種生物活性成分。另一方面，ADSC作為一種有潛力的間充質(zhì)干細胞，具有廣泛的應用前景，因此促進它在體外增殖速度，增強其增殖能力，將在ADSC的臨床干細胞治療方面提供一定的應用基礎(chǔ)。