蘇小茉，張美英，郭明洲

中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科醫(yī)學(xué)部，北京 100853

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤，其5年生存率仍低于10%[1]。胰腺癌的發(fā)病率呈逐年增長趨勢，目前已成為腫瘤致死原因的第3位，預(yù)計到2030年，胰腺癌將成為全球第2位的致死性腫瘤[2-3]。胰腺癌很少在40歲以前發(fā)生，其平均發(fā)病年齡為71歲，隨著人口老齡化，我國的胰腺癌發(fā)病率也呈快速增長趨勢。只有5%～10%的胰腺癌患者能夠用遺傳因素解釋[4]，具有種系突變的基因包括CDKN2A、MLH1、BRCA1、BRCA2、TP53和ATM[1]。對于無法手術(shù)的胰腺癌主要是依賴細(xì)胞毒性藥物，包括FOLFIRINOX、吉西他濱或白蛋白紫杉醇，以及脂質(zhì)體包裹的伊立替康和5-氟尿嘧啶等。

過去20年對腫瘤的研究主要聚焦于發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性的信號通路和代謝通路，并針對其進行靶向治療[5]。到目前為止，批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的小分子化合物和抗體主要是針對那些高度依賴具有促癌傾向信號通路的關(guān)鍵基因或蛋白，并且延長了一些難治腫瘤患者的生存期[6-8]。但大多數(shù)的靶向藥物，如抗血管增生藥物(貝伐單抗)、酪氨酸激酶抑制劑(西妥昔單抗)等對胰腺轉(zhuǎn)移癌均無明顯治療效果[1]。部分靶向藥物的療效處于改善的邊緣(延長患者生存期≤2個月)，另外一些靶向藥物使患者的預(yù)后更差，如結(jié)合MEK1/2和AKT抑制劑(Selumetinib和MK-2206)比FOLFIRINOX單用的預(yù)后更差[9]。令人失望的是，免疫關(guān)卡抑制劑PD-L1單抗(Durvalumab)和CTLA-4抗體在胰腺癌中的療效也非常有限[10-11]。目前正在進行的表觀遺傳治療的臨床試驗，主要是針對表觀調(diào)控作用的關(guān)鍵分子，雖然其靶向性較強，但由于缺乏腫瘤組織和正常組織之間的明顯差別或缺失的證據(jù)，除了在部分血液系統(tǒng)腫瘤外，在實體瘤中仍未獲得理想的效果[12-13]。也有報道，結(jié)合表觀治療和免疫治療能夠克服部分腫瘤的化療耐藥性[14]。胰腺癌的治療目前仍是一個挑戰(zhàn)性的問題?！皡f(xié)同致死”是一個新的概念，它來自于對生物遺傳模型的研究。其原理是具有決定細(xì)胞命運的兩個基因之間具有補償作用，其中一個基因在腫瘤中發(fā)生功能缺失，靶向另一個基因(其伙伴)將特異性地殺傷該腫瘤細(xì)胞。該治療策略選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞而不損傷正常細(xì)胞。應(yīng)用PARP抑制劑能夠特異性地殺傷因BRCA1/2突變的乳腺癌細(xì)胞是“協(xié)同致死”策略的典型代表[15]。

1 DNA損傷修復(fù)(DNA damage repair，DDR)機制及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療中的作用

在自然情況下，每天每個細(xì)胞可以通過各種內(nèi)外因素發(fā)生2×105個DNA損傷。外部因素包括紫外線、輻射和基因毒性藥物[16-17]，以太陽光來源的紫外線照射為例，每天每個細(xì)胞可以誘導(dǎo)1×105個DNA損傷[17-18]。內(nèi)源性因素多數(shù)來自于代謝的副產(chǎn)物，如活性氧。哺乳類動物細(xì)胞已經(jīng)進化出了一些信號通路和機制進行DDR。細(xì)胞的輕度DNA損傷可以經(jīng)過修復(fù)而恢復(fù)正常；如果DNA損傷不能修復(fù)將會通過死亡機制造成死亡而去除。研究表明，DDR系統(tǒng)經(jīng)常在腫瘤癌變的早期發(fā)生功能異常，而造成損傷的DNA不能完全修復(fù)產(chǎn)生突變、缺失、插入或其他異常[19]，腫瘤被認(rèn)為是驅(qū)動基因的累積性突變所導(dǎo)致的一種疾病[20]。

在哺乳類動物細(xì)胞內(nèi)存在6種關(guān)鍵的DDR通路，包括直接修復(fù)(direct repair)、錯配修復(fù)(mismatch repair，MMR)、堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)、核酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)、非同源末端連接修復(fù)(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重組修復(fù)(homologous recombination repair，HR)[19，21]。腫瘤的關(guān)鍵治療方法之一，就是利用化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷，而腫瘤細(xì)胞DDR的缺陷增加其對化療藥物的敏感性[19，22]。

分離和鑒定能夠作為藥物靶點的癌基因突變已經(jīng)大大改善了不同腫瘤的治療效果，如針對EGFR基因突變肺癌的分子靶向治療[23-24]。目前，絕大多數(shù)腫瘤靶向治療是直接靶向激活性癌基因突變或異常獲得的基因功能(gain of function)，包括基因突變、基因擴增和基因融合；不幸的是，非常有限數(shù)量的高頻基因突變位點能夠作為治療的分子靶標(biāo)。而且，某些已經(jīng)明確的基因突變位點或異常表達的基因不能作為直接的分子治療靶標(biāo)，如“功能缺失”(loss of function)或因基因突變導(dǎo)致的表達缺失均很難應(yīng)用藥物恢復(fù)其活性，并且?guī)缀鯚o成功的例子[13，25-26]。

DDR系統(tǒng)是由具有檢測DNA損傷的感應(yīng)器(蛋白)和下游的效應(yīng)器組成的，它們依次通過阻滯細(xì)胞周期的進展，然后促進DDR。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時，細(xì)胞周期的關(guān)卡將被激活，將其阻滯在G1期、S期和G2/M期[27-28]。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時，需要延遲細(xì)胞周期的進展，給DNA的修復(fù)提供一定的時間。如DNA發(fā)生雙鏈損傷時，毛細(xì)血管擴張共濟失調(diào)突變激酶(ataxia telangiectasia mutated kinase，ATM)將被激活，然后通過激活細(xì)胞周期檢驗點激酶2(checkpoint kinase 2，Chk2)而激活G1期關(guān)卡，阻滯細(xì)胞進入S期[29]。DNA損傷還可通過激活毛細(xì)血管擴張共濟失調(diào)癥與Rad3相關(guān)激酶(ataxia telangiectasia and Rad3 related kinase，ATR)，然后通過激活細(xì)胞周期檢驗點激酶1(checkpoint kinase 1, Chk1)，而阻滯細(xì)胞進入S期[30]。ATR和Chk1也可通過激活G2/M期關(guān)卡而阻止DNA損傷的細(xì)胞進入有絲分裂期(M期)[31]。當(dāng)細(xì)胞的DNA損傷比較嚴(yán)重而無法修復(fù)時，將會促使細(xì)胞進入有絲分裂期，通過有絲分裂災(zāi)難(maitotic castrophe)機制而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[32]。促使發(fā)生DNA損傷的腫瘤細(xì)胞進入有絲分裂期將會實質(zhì)性地提高療效。

2 “協(xié)同致死”原理及其在分子靶向治療中的應(yīng)用

“協(xié)同致死”的概念來源于對果蠅模型的研究，用于描述兩個或更多基因同時發(fā)生突變而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[33]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞存在DDR的異常改變時，我們可以應(yīng)用“協(xié)同致死”策略進行精準(zhǔn)治療。其基本原理是，腫瘤細(xì)胞中的一個DDR通路存在缺陷時，需要依賴另外的補償通路而存活，通過阻斷其補償通路將會達到“協(xié)同致死”的目的。最經(jīng)典的例子是在BRCA1/2缺失的細(xì)胞，應(yīng)用PARP抑制劑而誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡[13，34-36]。BRCA1/2參與DNA的同源重組修復(fù)，PARP參與DNA的單鏈修復(fù)，這兩個通路互為補償通路，因此，當(dāng)BRCA1/2功能缺失時，應(yīng)用PARP抑制劑將會促進具有DNA損傷的細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難而死亡。值得注意的是，“協(xié)同致死”原理可以用于探索無法靶向的抑癌基因的突變和直接靶向治療非常困難的癌基因的分子靶向治療策略，通過靶向其具有“協(xié)同致死”效應(yīng)的伙伴而獲得突破性效果[37]。

為了應(yīng)對DNA損傷，細(xì)胞進化出幾個重疊和互補的DDR通路。DNA損傷時，一些關(guān)鍵蛋白參與DNA損傷與細(xì)胞周期關(guān)卡和DNA修復(fù)通路之間的信號傳導(dǎo)，例如ATM、ATR和DNA-PKcs[38]。隨著對DDR機制的深入理解，新的針對DDR關(guān)鍵分子的靶向治療成為抗癌治療的新策略。潛在的治療靶標(biāo)很多，約有450個基因編碼的蛋白參與DDR。除了PARP1/2抑制劑外，大量的DDR關(guān)鍵分子的抑制劑正在進行臨床試驗，如：CBP-501和Prexasertib(Chk1/2抑制劑)、AZD-1775(WEE1抑制劑)、AZD-6738和VX-970(ATR抑制劑)、LY-3023414(DNA-PK抑制劑)和AZD-0156(ATM抑制劑)[37，39]。

3 “協(xié)同致死”機制應(yīng)用的新策略——“BRCAness”

在腫瘤中，應(yīng)用PARP抑制劑治療BRCA1/2突變的細(xì)胞是一個完美的“協(xié)同致死”治療模型，目前幾乎所有的“協(xié)同致死”研究均局限于BRCA1/2的突變。然而，BRCA1/2突變在多數(shù)腫瘤中均非常少見。通過對該模型生物學(xué)功能的學(xué)習(xí)和深度分析，發(fā)現(xiàn)任何DDR的關(guān)鍵調(diào)控分子的缺陷均可能成為“協(xié)同致死”的標(biāo)志物，如ATM、ATR、PALB2、MGMT、SLFN11、FANCC、GSTpi等。大量不同類型的DDR抑制劑正在進行臨床前期或臨床試驗，但這些DDR抑制劑在“協(xié)同致死”中的應(yīng)用需要進行廣泛的研究[22，40]。

Roberti等根據(jù)Rad51和BRCA2相互作用而影響DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)功能，通過篩選小分子化合物庫獲得了40多個三唑衍生物(triazole derivative)能夠破壞Rad51-BRCA2之間的相互作用而影響DNA的雙鏈斷裂修復(fù)，從而模擬了BRCA2的突變。這些三唑衍生物能夠和奧拉帕尼(Olaparib)協(xié)同靶向殺傷BRCA2功能正常的胰腺癌細(xì)胞[41-42]。另外，一些腫瘤相關(guān)的信號通路，通過直接參與或通過影響細(xì)胞周期而參與DDR，如：PI3K、AKT、Wnt、SMAD4等信號通路[43-44]。弄清DDR通路之間的補償機制和網(wǎng)絡(luò)將極大地促進“協(xié)同致死”策略在腫瘤中的廣泛應(yīng)用。

絕大多數(shù)腫瘤同時具有遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的異常改變，遺傳和表觀遺傳可以相互作用而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[45]。與抑癌基因的失活性突變相似，抑癌基因的表觀遺傳沉默可以導(dǎo)致其參與的信號通路的功能缺失。因此，表觀遺傳調(diào)控直接參與Knudson的“二次打擊”事件，是對Knudson“二次打擊”學(xué)說的補充[13]。

4 基于遺傳和表觀遺傳異常改變的“協(xié)同致死”策略及其在胰腺等腫瘤中的應(yīng)用

最近的一項研究表明，BRCA1/2種系突變的胰腺癌患者在順鉑治療后，與安慰劑量組相比，應(yīng)用奧拉帕尼(PARP抑制劑)維持治療可以延長患者的無進展生存期(7.4個月vs3.8個月)[46]。另外一項在小鼠和人的胰腺癌模型中針對ATM基因突變的研究發(fā)現(xiàn)，ATM功能缺失能夠明顯增加對PARP、ATR和DNA-PKcs抑制劑的敏感性[47]。在胰腺癌中還有許多DDR相關(guān)基因發(fā)生突變，這些驅(qū)動基因突變有望成為新的“協(xié)同致死”治療的靶標(biāo)，如ABRAXAS1、APC、BARD1、BRIP1、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MRE11、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、PALB2、PIK3CA、PMS2、PTEN、RAD50、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53、XRCC2等[48]。

除了經(jīng)典的DDR基因外，一些涉及細(xì)胞周期、Wnt、TGF-β、PI3K等信號通路的關(guān)鍵分子也會直接或間接影響DDR或細(xì)胞命運，這些關(guān)鍵基因的表觀遺傳沉默為腫瘤的“協(xié)同致死”治療策略提供了新的機遇。DDR、細(xì)胞周期、Wnt、TGF-β、PI3K-AKT-mTOR和其他信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子在許多腫瘤中均頻繁發(fā)生啟動子區(qū)的甲基化[45，49-51]。我們過去的研究在胰腺內(nèi)分泌腫瘤中發(fā)現(xiàn)，DDR相關(guān)基因MGMT、MLH1 GST-pi和RASSF1A頻繁發(fā)生甲基化[52]。另外的研究發(fā)現(xiàn)，MLH1在胰腺癌中頻繁發(fā)生甲基化，且其甲基化與微衛(wèi)星不穩(wěn)定相關(guān)[53]。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，BET抑制劑(JQ1)不僅能夠抑制同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白RAD51的表達，而且能夠抑制非同源重組末端鏈接修復(fù)蛋白Ku80在胰腺癌細(xì)胞中的表達。JQ1在體內(nèi)外均可增加胰腺癌對PARP抑制劑(Veliparib或Olaparib)的敏感性[54]。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，NRN1基因在食管癌中的甲基化率為50.4%(510/1 012)，且其表達受啟動子區(qū)甲基化調(diào)控，NRN1在體內(nèi)外通過抑制PI3K-mTOR信號通路而抑制食管癌的生長，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，NRN1甲基化是PI3K和ATR抑制劑的“協(xié)同致死”標(biāo)志物[55]。我們在胰腺癌和癌前病變中發(fā)現(xiàn)DDR基因MGMT、MLH1、CHFR、SLFN11和RASSF1A頻繁發(fā)生甲基化，為胰腺癌的“協(xié)同致死”治療提供了依據(jù)。

5 展望與挑戰(zhàn)

針對蛋白之間的相互作用進行靶向治療是一個極具吸引力的藥物設(shè)計策略，但鑒定和優(yōu)化相互作用蛋白質(zhì)之間的特異抑制劑是一項非常困難的工作，因為這些蛋白常常與其他蛋白之間相互作用，使得根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點獲得最佳配體非常困難[41]。

表觀遺傳學(xué)改變在一定條件下可以逆轉(zhuǎn)，這一特性為腫瘤的治療提供了新的機遇。目前常用的表觀遺傳治療，主要是針對表觀遺傳調(diào)控的關(guān)鍵分子，如甲基化酶抑制劑5′-Aza、HDAC抑制劑FK228和EZH2的抑制劑DZNep/GSK126等。雖然在血液系統(tǒng)腫瘤治療中獲得了一定的效果，但在實體瘤中的效果尚不明顯，且由于其靶向組織的非特異性導(dǎo)致比較明顯的毒副作用。如何靶向特定腫瘤組織中特定基因的啟動子區(qū)是一個尚未解決的難題?；诒碛^遺傳異常的“協(xié)同致死”治療策略，是通過靶向表觀遺傳異常通路的補償通路，而特異性的殺傷表觀遺傳異常的腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞。在許多腫瘤中DDR基因和細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵基因也發(fā)生頻繁甲基化[19，49]。因此，基于表觀遺傳異常的“協(xié)同致死”治療策略將具有更廣泛的應(yīng)用前景[13，22]。