余 輝，龔春燕，江 麗，曹月霞，李新宇#

(1.中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210042； 2.中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院藥物研究室，江蘇 南京 210042)

祛風顆粒是中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院獲得江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局備案號的傳統(tǒng)中藥制劑(備案號為：蘇藥制備字Z20200003000)，該方以君藥黃芪、防風、荊芥、升麻和浮萍祛風升陽固表；以臣藥制何首烏、蟬蛻?zhàn)B血祛風止癢；佐以厚樸、茵陳、地膚子、白鮮皮和黃連，行氣祛濕；甘草為使藥，調(diào)和諸藥，在臨床上用于慢性蕁麻疹、皮膚瘙癢等慢性頑固性皮膚病的治療，效果肯定[1-2]。由于該方在臨床上開具為水煎劑，攜帶儲藏不便，遂將其開發(fā)為顆粒劑[3]。本課題組用正交設計法對其進行了提取工藝的研究[4]，以干膏率及君藥防風中升麻素苷的含量作為綜合評定指標[5-6]，并對方中君藥、臣藥進行薄層色譜研究[7]，篩選出黃芪、制何首烏及黃連3味藥材的薄層鑒別作為質(zhì)控方法。

1 材料

1.1 儀器

薄層硅膠預制板(青島海洋化工廠)；METTLER AE240S型電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司]；ZF-I型三用紫外分析儀(上海舒源分析儀器廠)；KH-250B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；XL-200 A型多功能搖擺式粉碎機(上海潤實電器有限公司)；微量進樣器(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；Waters 2695 HPLC型高效液相色譜儀，數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)為Waters Empower 2軟件，檢測器為Waters 2998 PDA檢測器，購自沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 藥品與試劑

黃連(三角葉黃連)對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：120913-201611)；制何首烏對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121454-201405)；黃芪(蒙古黃芪)對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：120974-201612)；升麻素苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111522-201712)；三批祛風顆粒中試樣品(批號：180701、180702及180703)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝研究

方中黃芪、防風和荊芥等中藥均為水溶性有效成分，沿用臨床使用的水煎劑提取方法，進行提取工藝試驗研究。首次提取前用水煎劑步驟浸泡藥材30 min，充分浸潤藥材，并對影響有效成分的3個重要因素加水量、提取次數(shù)和提取時間進行正交設計考察，確定最佳提取工藝。

2.1.1 評定指標：為確定是否充分提取有效中藥成分，將提取液濃縮、干燥所得的干浸膏得率和君藥防風中主要指標成分升麻素苷含量作為綜合評定指標。并設定干浸膏得率權(quán)重為0.3，有效成分升麻素苷含量權(quán)重為0.7，兩者加權(quán)值為綜合評定指標。

(1)干浸膏得率測定。將提取工藝試驗得到的提取液濃縮，置于已干燥至恒重的不銹鋼皿中，真空干燥箱中60 ℃烘干，稱重得干浸膏質(zhì)量除以藥材總質(zhì)量即得干浸膏得率。

(2)升麻素苷含量測定。①色譜條件。色譜柱為Waters semmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 mm)，檢測器為Waters 2998 PDA檢測器，以乙腈-0.1%磷酸為流動相，梯度洗脫(見表1)，流速為1.0 ml/min，波長為254 nm。②對照品溶液制備。精密稱取升麻素苷對照品10.03 mg(純度分別為96.2%)，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取5 ml置于50 ml容量瓶中，用20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml中含升麻素苷20.06 μg的對照品溶液。③樣品溶液制備。取20 g干浸膏粉，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加75%甲醇100 ml，稱定質(zhì)量，90 ℃回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液備用。

表1 洗脫程序

2.1.2 正交設計方案及結(jié)果：采用L9(34)正交設計法，對影響有效成分提取的主要因素A(加水量)、B(提取次數(shù))和C(提取時間)進行考察，每個因素設3個水平進行優(yōu)選，因素與水平見表2。正交試驗設計方案與結(jié)果見表3。

2.1.3 結(jié)果分析：對正交試驗結(jié)果進行方差分析，見表4。

表2 因素與水平

表3 正交試驗設計方案與結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

查分布表：F0.05(2,2)=19.000，F(xiàn)0.10(2,2)=9.000，因素A、B、C對試驗指標均無顯著性影響。

對試驗結(jié)果進行直觀分析，根據(jù)工藝正交試驗方案，最佳提取方案為A3B3C1，但方案A1B3C3、A3B2C1和A3B3C2加權(quán)指標值差異不大，對上述3個方案進行重復性試驗，每個方案重復3次，對評定指標取平均值，再進行加權(quán)指標值計算，結(jié)果見表5。

表5 重復性試驗結(jié)果

根據(jù)表5結(jié)果，8號試驗方案A3B2C1加權(quán)指標值最優(yōu)，與正交試驗最優(yōu)方案A3B3C1比較，減少了1次煎煮步驟，根據(jù)正交試驗方差分析，試驗因素A、B和C對試驗指標均無顯著性影響，結(jié)合實際生產(chǎn)，減少能耗，提高煎煮效率，同時兼顧干浸膏得率和升麻素苷含量，確定A3B2C1因素水平為最終提取工藝，即煎煮提取2次，每次加12倍量水，每次60 min，首次煎煮前浸泡30 min。

2.2 薄層色譜研究

2.2.1 黃芪：取本品10 g，加乙醇30 ml，加熱回流20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.3%氫氧化鈉溶液15 ml使其溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至5～6，用乙酸乙酯15 ml振搖提取，分取乙酸乙酯液，用鋪有適量無水硫酸鈉的濾紙濾過，濾液蒸干。殘渣加乙酸乙酯1 ml使其溶解，作為供試品溶液。另取黃芪對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典：一部》(2015版)通則0502]，吸取上述2種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇(V∶V=20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后，置紫外光燈(254 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，見圖1。

B.陰性供試品；S1.供試品(180701)；S2.供試品(180702)；S3.供試品(180703)；R.對照藥材B. negative test samples; S1. test samples (180701); S2. test samples (180702); S3. test samples (180703); R. reference samples

2.2.2 制何首烏：取本品10 g，加乙醇50 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至3 ml，作為供試品溶液。另取制何首烏對照藥材粉末0.25 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典：一部》(2015版)通則0502]，吸取對照藥材溶液5 μl、供試品溶液10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(V∶V∶V∶V=4∶1∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；置氨蒸汽中熏后，有1個相同的紅色斑點，見圖2。

Ⅰ.365 nm；Ⅱ.氨汽熏蒸；B.陰性供試品；S1.供試品(180701)；S2.供試品(180702)；S3.供試品(180703)；R.對照藥材Ⅰ.365 nm；Ⅱ.ammonia fumigation；B. negative test samples; S1. test samples (180701); S2. test samples (180702); S3. test samples (180703); R. reference samples

2.2.3 黃連：取本品10 g，加甲醇25 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取黃連對照藥材0.25 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典：一部》(2015版)通則0502]，吸取對照藥材溶液1 μl，供試品溶液5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-三乙胺(V∶V∶V∶V∶V=3∶3.5∶1∶1.5∶1)為展開劑，置于用濃氨試液預飽和20 min的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜圖中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯2個以上相同顏色的熒光斑點，見圖3。

B.陰性供試品；S1.供試品(180701)；S2.供試品(180702)；S3.供試品(180703)；R.對照藥材B. negative test samples; S1. test samples (180701); S2. test samples (180702); S3. test samples (180703); R. reference samples

3 討論

本研究在用正交試驗優(yōu)選最佳提取工藝時，綜合了直觀分析和方差分析。方差分析結(jié)果顯示，3個試驗因素均對評定指標無顯著性影響；再進一步對指標值接近的3、8和9號方案各進行了3次重復性試驗，各方案試驗后的平均指標值顯示，8號方案優(yōu)于3、9號方案。這可能是由于正交試驗時各方案僅進行1次試驗，在煎煮時指標成分提取不充分造成的，也說明對優(yōu)選方案進行重復性試驗的必要性，最終結(jié)合實際生產(chǎn)能耗，優(yōu)選出最合適的提取工藝。

本研究在進行薄層色譜方法的篩選時，參考《中華人民共和國藥典：一部》及文獻[8-13]，采用逐味藥材篩選和個別藥材篩選相結(jié)合的辦法。例如，黃連中特征成分的薄層色譜斑點明顯，不易受到干擾，因此，先用其色譜系統(tǒng)對中試樣品顆粒進行了試驗，結(jié)果顯示，方法可行。

本研究在進行制何首烏鑒別方法摸索時，制何首烏的藥典處理方法較為復雜，在進行篩選時發(fā)現(xiàn)：采用升麻的處理方法處理樣品后，再用當歸的展開系統(tǒng)展開時，制何首烏的特征斑點明顯，且用硅膠G板即可很好地展開，無拖尾現(xiàn)象，較為合適，故調(diào)整優(yōu)化后得到可行的薄層鑒別方法[14-15]。

薄層鑒別試驗中還對薄層板進行了耐用性試驗，3個不同廠家的硅膠薄層板均重現(xiàn)性良好。