王友強，蘭由玉，李世勇

（西南醫(yī)科大學：1附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗科；2附屬醫(yī)院風濕免疫科，四川瀘州 646000）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以關節(jié)及其周圍組織受累為主，多種致病因素參與了RA 的發(fā)病，隨著疾病的進展，可導致患者關節(jié)畸形及其生活質量的嚴重下降[1-2]。CC 趨化因子受體5（C-C chemokine receptor 5，CCR5）是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，可通過調節(jié)白細胞的趨化活性在免疫和炎癥反應中發(fā)揮重要作用[3-4]，但關于CCR5 在RA 中的具體作用機制還有待進一步的研究。隨著高通量生物醫(yī)學實驗方法的廣泛應用，使深入研究疾病的分子機制成為現(xiàn)實，如生物信息學網(wǎng)絡分析可幫助發(fā)現(xiàn)RA 診治的潛在靶點[5-7]。本研究擬利用生物信息學分析GEO中RA相關的基因芯片數(shù)據(jù)，篩選RA 差異基因，并從中探尋CCR5在RA患者的表達情況及其在RA中可能的作用，以此驗證CCR5參與RA發(fā)病的遺傳學證據(jù)；再通過實驗驗證CCR5在RA大鼠異常表達的組織學證據(jù)，從而為后續(xù)進一步的探究CCR5 的作用機制研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 數(shù)據(jù)來源及在線分析工具如下：

GEO：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；

GEO2R：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/；

limma包：http：//master.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html；

jvenn：http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html。

1.1.2 實驗動物

SPF 級Wistar 雄性大鼠20 只，體重（171 ± 8）g，購買于西南醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗通過了西南醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.3 主要試驗試劑及儀器

弗氏完全佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）（美國，Sigma公司）、Trizol Reagent（日本，Taka?ra 公司）、逆轉錄試劑盒（美國，Promega 公司）、轉膜液（上海碧云天生物技術有限公司）、CCR5 抗體（英國，Abcam公司）、二抗（兔抗羊IgG）（英國，Abcam公司）、PCR 試劑盒（日本，Takara 公司）、ABI7500 定量PCR 儀（美國，ABI 公司）、WB 顯像儀（美國，BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學篩選RA差異基因

在GEO數(shù)據(jù)庫中以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞檢索RA 的基因芯片，GSE 97779、GSE 77298、GSE 10500、GSE 55457 和GSE 1919 這5 個數(shù)據(jù)集被用于差異基因篩選，數(shù)據(jù)集的樣本、注釋平臺等詳細信息見表1。GEO2R 和limma 包對數(shù)據(jù)信息進行分析，以P.Value ＜0.05 和|Log Fold Change|＞2 的基因被確定為差異表達基因，jvenn 是web 環(huán)境的開源組件，可以對含有不同元素的集合進行比較并繪制Venn圖，這里用jvenn比較5個基因芯片的差異基因。

表1 類風濕性關節(jié)炎數(shù)據(jù)集信息

1.2.2 RA大鼠模型構建

將選購的SPF級Wistar雄鼠20只，體重（171±8）g，飼養(yǎng)1周后再隨機分配為Control和RA 兩組，每組各10只。RA組的10只Wistar雄鼠用于構建RA大鼠CIA模型。具體方法為：將Ⅱ型膠原蛋白充分溶解于濃度為0.1 mmol/L 的醋酸溶液中，然后再將相同劑量的弗氏完全佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA）充分與上述混合液一起混勻，最后放置在冰浴中待其完全乳化；用注射器在Wistar 雄鼠尾根部多處注射，同樣的方法再于1 周后重復操作一次；con?trol組的Wistar雄鼠在同樣的時間、同樣的部位僅注射Ⅱ型膠原蛋白0.2 mg。采用關節(jié)炎癥指數(shù)(Arthri?tis index，AI)評分法評估RA 大鼠模型是否構建成功，AI大于或等于4分提示造模成功，四肢評分標準見表2，每隔5 d觀察一次。

表2 AI評分標準

1.2.3 HE染色

每組大鼠斷頸處死，逐漸剝離出膝關節(jié)滑膜組織后，經(jīng)過固定、透明制作成石蠟切片。每組取5 張切片，先后經(jīng)過脫蠟、乙醇梯度脫水及蒸餾水清洗后，用蘇木精上色5 min，水流沖刷3 s，再先后用鹽酸、水流分別沖刷清洗3 s，然后用伊紅染料室溫下著色2 min，去除染色液后分色2～3 s，經(jīng)清洗、返藍后，伊紅再次上色1 min。將上述處理過的切片再先后予以梯度脫水、透明化、封片處理后鏡檢。鏡下觀察切片，胞核表現(xiàn)為藍色，胞質則為紅色。

1.2.4 免疫組化檢測CCR5 在大鼠滑膜組織的表達情況

每組取5 張切片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，室溫下，3%的H2O2溶液浸泡切片10 min后，用蒸餾水洗滌切片，每次5 min，共3次。再將切片放在含有枸櫞酸鹽Buffer（pH=6.0，0.01 nmol/L）的容器中充分浸泡，然后進行抗原修復。常溫下，切片用正常羊血清（PBS 稀釋至濃度為10%）封閉15～20 min，去除血清后再滴入一抗溶液（羊抗鼠的CCR5抗體），4 ℃過夜。PBS 清洗后滴入PBS 稀釋的生物素標記的二抗（兔抗羊IgG），常溫30 min。PBS 洗滌后加入鏈霉素卵蛋白工作液，常溫擱置30 min。PBS 洗滌5 min×4次，DAB 顯色處理后，用水沖洗，然后蘇木素再次染色，乙醇梯度脫水，透明化處理，封片后光鏡下觀察。

1.2.5 CCR5 mRNA及蛋白水平的檢測

各組滑膜組織用Trizol 法提取總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，再以GAPDH 為內參基因，將cDNA 進行PCR 擴增，反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環(huán)，引物序列見表2?；そM織加入蛋白裂解液提取蛋白，再利用10%SDS分離膠與濃縮膠電泳分離、轉膜，滴加稀釋的一抗兔抗鼠CCR5，4 ℃孵育過夜；加入二抗37 ℃振蕩孵育l h后用化學發(fā)光儀檢測。

表2 引物基因序列

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 21.0 分析所得數(shù)據(jù)，定量數(shù)據(jù)以均值±標準差（）表示，兩個樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，以P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學篩選RA 差異基因以及CCR5 在RA患者的表達情況

GEO 數(shù)據(jù)庫中RA 芯片GSE 97779、GSE 77298、GSE 10500、GSE 55457和GSE 1919篩選差異表達基因，篩選條件為P.Value ＜0.05 和|LogFoldChange| ＞2。在GSE 1919中，CCR5在RA組中的量是control組的5.74倍（22.52），說明RA患者CCR5的表達量明顯高于正常人（P ＜0.05），如圖1A；繪制GSE 77298 前70個差異基因的表達熱圖（圖1B）提示CCR5 在RA 中的表達比control 組高；另外在GSE 97779、GSE 10500 和GSE 55457 芯片中，CCR5 的表達情況分別如圖1C-1E所示，CCR5在RA患者中異常高表達。最后選取每種芯片前400 個基因進行比較，繪制Venn圖（圖1F）發(fā)現(xiàn)有1個交集基因-CCR5，說明CCR5在5個芯片均差異表達，可能是影響RA的一個重要因子。

圖1 生物信息學篩選結果及CCR5相對表達量的比較

2.2 RA大鼠模型鑒定

在給大鼠注射弗氏完全佐劑（CFA）8 h 后，RA組大鼠在注射一側足趾部位出現(xiàn)紅腫等關節(jié)炎癥的表現(xiàn)，24 h 出現(xiàn)足踝部腫脹。10 d 后RA 模型大鼠表現(xiàn)出多關節(jié)炎，具體表現(xiàn)為前肢或對側肢體，甚至耳部和尾部均有前面所述的炎癥反應的表現(xiàn)。皮毛缺少光澤，體重減輕，精神稍萎靡，隨著時間的延長，少數(shù)還可見脫皮、潰瘍等。10 d后RA組大鼠AI明顯升高，且隨時間增加逐漸上升（P ＜0.05），至25 d 時AI（7.12±1.13）較10 d（1.21±0.73）、15 d（4.87±1.21）時進一步增高（P ＜0.05），見圖2。而對照組大鼠無關節(jié)炎癥等表現(xiàn)。由此可見RA大鼠模型構建成功。

2.3 RA大鼠滑膜組織病理形態(tài)變化

HE染色顯示，與control組對比，RA組關節(jié)內滑膜增生，部分滑膜剝脫缺失，關節(jié)間隙稍增寬，骨及軟骨輕微破壞，并向關節(jié)腔內突出，有較多炎性細胞浸潤，軟組織明顯腫脹，可見新生血管翳形成，由此進一步提示RA大鼠模型構建是成功的。

圖2 RA組大鼠關節(jié)炎指數(shù)（AI）

圖3 RA大鼠滑膜組織病理形態(tài)比較

2.4 免疫組化測定CCR5在大鼠滑膜組織的表達情況

為證實CCR5 在RA 大鼠滑膜組織中的表達情況，如圖3所示，本研究利用免疫組化染色方法可以更直觀的了解CCR5 在大鼠滑膜細胞的表達情況，與對照組相比，RA 組CCR5 陽性率明顯增加（P ＜0.001），說明CCR5在RA中表達增加，與生物信息學結果一致。

圖4 免疫組化染色及CCR5陽性率比較

2.5 CCR5 mRNA和蛋白水平的表達情況

利用qRT-PCR 和Western Blot 方法進一步了解CCR5 mRNA和蛋白水平在RA大鼠滑膜組織中的表達情況，如圖4 所示，與對照組對比，RA 組CCR5 mRNA 和蛋白水平明顯升高（P ＜0.05），由此可知，生物信息學分析結果與實驗結果一致，進一步表明RA大鼠CCR5表達水平是明顯升高。

圖5 各組滑膜組織CCR5 mRNA和蛋白水平的表達情況及比較

3 討論

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性進行性自身免疫性疾病，與多種遺傳、表觀遺傳學和環(huán)境因素有關，這些因素可影響關節(jié)，從而導致軟骨和骨骼損傷，最終出現(xiàn)關節(jié)畸形和殘疾[8-9]。盡管RA的病機尚不清楚，但有研究顯示其慢性關節(jié)發(fā)炎歸因于滑膜細胞的嚴重增殖、滑膜炎以及免疫細胞的浸潤等[10-11]，并且滑膜細胞在RA 的炎癥和增殖過程中具有重要作用[12-13]。

CCR5，即CC-趨化因子受體5，是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），屬于趨化因子受體家族，其主要功能是通過調節(jié)白細胞的活化和定向遷移來調控免疫炎癥反應[14]。有研究[15-16]發(fā)現(xiàn)RA患者CCR5的表達是增加的，這與生信分析結果一致。有研究者利用生物信息學發(fā)現(xiàn)，CCR5、CCR7、CXCR4、CCL5和CCR4等關鍵基因參與了RA的疾病進展，其中趨化因子信號通路是介導成纖維樣滑膜細胞（FLS）遷移、侵襲和釋放趨化性的關鍵途徑，是RA主要的信號通路之一[6],并且還發(fā)現(xiàn)CCL5及其相關基因可能是RA治療策略的潛在生物標志物[17]。

本研究從GEO中篩出RA芯片數(shù)據(jù)集GSE 97779、GSE 77298、GSE 10500、GSE 55457 和GSE 1919，分別用GEO2R 和limma 包篩選RA 差異基因發(fā)現(xiàn)有較多差異基因，有待進一步確定關鍵基因。但Venn 圖的結果發(fā)現(xiàn)有1 個交集基因中有且僅有一個基因——CCR5，說明CCR5 是5 個芯片中唯一共有的差異基因，提示其可能是影響RA 的一個關鍵基因。生物信息學分析還提示，CCR5 在RA 患者中的表達明顯比對照組高，說明CCR5 在RA 患者中是高表達的，可能參與了RA的發(fā)病，由此可見，利用生物信息學方法驗證CCR5 參與RA 發(fā)生發(fā)展的遺傳學證據(jù)是可行的，同時為發(fā)現(xiàn)RA的分子機制和診治目標提供線索和方向[18-19]。

為進一步驗證CCR5在RA大鼠的表達情況，研究通過RT-PCR、Western Blot 以及免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，CCR5在RA大鼠滑膜組織中高表達，這與生物信息學分析結果一致，同時也為后續(xù)利用RA大鼠模型研究CCR5具體的作用機制奠定了基礎。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)CCR5 在RA 患者中呈異常高表達水平，且參與了RA 發(fā)病，進一步的實驗驗證發(fā)現(xiàn)CCR5 在RA 大鼠滑膜組織也是高表達的，這為下一步利用RA 大鼠模型研究CCR5 的具體作用機制奠定了基礎，同時也說明我們可以利用生物信息學發(fā)現(xiàn)RA的關鍵基因，并結合實驗方法驗證CCR5參與RA發(fā)生發(fā)展的遺傳學和組織學證據(jù)，從而為后續(xù)的機制研究奠定基礎，但CCR5在RA中的具體作用機制還有待進一步研究。