何麗媛， 陳 晶， 劉艾蕓

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150086

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，全世界CRC的發(fā)病率正在逐年上升[1-2]。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，50歲以下年齡段的CRC發(fā)病率近年來(lái)有明顯的上升趨勢(shì)[3]。中國(guó)近10年來(lái)CRC發(fā)病率和死亡率均呈明顯的升高趨勢(shì)[4]。在CRC早期或腺瘤期發(fā)現(xiàn)病灶并及時(shí)切除是降低CRC患者相關(guān)死亡率的有效方法。術(shù)后有效的藥物治療有利于預(yù)防CRC的復(fù)發(fā)，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間[5]。雖然結(jié)腸鏡水平較前有很大的進(jìn)步，化療藥物的種類(lèi)和療效較前也有所提高，但目前CRC的預(yù)防和治療仍是重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。這些情況表明，早期診斷CRC進(jìn)而采取相應(yīng)治療措施是非常有必要的，其中早期診斷顯得尤為重要。CRC從腺瘤到侵襲性癌的進(jìn)展是一個(gè)多步驟、多因素綜合參與的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，一系列癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)與CRC進(jìn)展密切相關(guān)，其中抑癌基因表達(dá)受到抑制被認(rèn)為是觸發(fā)腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制[6]。因此，通過(guò)檢測(cè)某些基因從而在腫瘤早期及時(shí)干預(yù)并阻止腫瘤進(jìn)展能大大提高CRC的早期診斷和預(yù)后。

1 NPRL2基因結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

1.1 NPRL2基因的結(jié)構(gòu)NPRL2(又稱(chēng)抑癌候選基因4,TUSC4)早在30年前就被認(rèn)為是抑癌基因，在生物物種間具有高度保守性。NPRL2位于染色體3p21.3區(qū)域，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NPRL2基因及其產(chǎn)物在人類(lèi)多種癌組織和癌細(xì)胞系中出現(xiàn)了功能障礙和大量蛋白表達(dá)丟失的現(xiàn)象，其機(jī)制可能是基因異常剪接、轉(zhuǎn)錄及多個(gè)外顯子缺失或基因內(nèi)純合子缺失導(dǎo)致NPRL2基因克隆的無(wú)義和錯(cuò)義突變，結(jié)果為NPRL2基因表達(dá)下調(diào)或沉默[7]。NPRL2的雜合性丟失和純合子缺失經(jīng)常發(fā)生在人類(lèi)各種類(lèi)型癌癥的早期發(fā)展階段[7-8]。NPRL2基因通過(guò)不同剪接方式編碼成多種剪接異構(gòu)體在不同組織中表達(dá)。NPRL2蛋白是NPRL2基因編碼的由380個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，表達(dá)于人體多種組織和器官，包括肺和睪丸[7]。

1.2 NPRL2基因在腫瘤組織中的生物學(xué)功能人類(lèi)多種正常組織可以表達(dá)NPRL2基因，但發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤組織中NPRL2基因表達(dá)較正常組織減少或增加[9-10]。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物中，NPRL2可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并增強(qiáng)對(duì)包括順鉑在內(nèi)的許多抗癌藥物的敏感性[11]。在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，NPRL2基因在前列腺癌組織中表達(dá)異常升高，干擾NPRL2在前列腺癌組織中的表達(dá)后，癌組織的凋亡增加，侵襲和轉(zhuǎn)移受到抑制[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，NPRL2在人類(lèi)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)降低，上調(diào)NPRL2表達(dá)可以通過(guò)抑制PDK1-AKT1信號(hào)通路及其下游基因的活性，顯著抑制膠質(zhì)瘤的增殖[13]。在一些腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，NPRL2基因的抑癌效果可能是通過(guò)參與DNA錯(cuò)配修復(fù)、調(diào)控細(xì)胞周期信號(hào)傳導(dǎo)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖等途徑作用的[7-8]。此外，NPRL2基因過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制自噬相關(guān)通路的mTORC1蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自噬，抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，這一機(jī)制已在前列腺癌的研究中被證實(shí)[14]。共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ataxia telangiectasia mutated，ATM)是與DNA損傷檢驗(yàn)有關(guān)的一個(gè)重要基因，前列腺癌細(xì)胞中ATM蛋白水平高于正常組織，p-ATM(phospho-ATM)是ATM的磷酸化形式，p-ATM的激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活。NPRL2是ATM的正調(diào)控因子，在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，NPRL2通過(guò)增加ATM和p-ATM，保護(hù)前列腺癌細(xì)胞，促進(jìn)其生長(zhǎng)[15-17]。由此看出，抑癌基因NPRL2通過(guò)不同的信號(hào)通路對(duì)不同類(lèi)型腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后產(chǎn)生不同的效果。

1.3 NPRL2基因的其他生物學(xué)功能有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，敲除了NPRL2基因的動(dòng)物肌肉纖維明顯更大，纖維型組成改變，快速收縮糖酵解纖維增多，慢收縮氧化纖維減少[18]。敲除了肌肉中NPRL2基因后的小鼠跑步行為發(fā)生了改變，葡萄糖耐量比之前增強(qiáng)。此外，還發(fā)現(xiàn)NPRL2基因的缺失會(huì)誘導(dǎo)有氧糖酵解并抑制葡萄糖進(jìn)入檸檬酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA)[18]。NPRL2基因的突變與局灶性癲癇發(fā)作有一定聯(lián)系[19]。此外，還發(fā)現(xiàn)NPRL2突變體果蠅的胃腸道衰老過(guò)程加快。NPRL2突變體果蠅的中腸可表現(xiàn)出腸道長(zhǎng)度短、腸道干細(xì)胞增殖率高、代謝功能紊亂等與年齡相關(guān)的表型[20]。

2 NPRL2在CRC中的抗腫瘤作用

2.1 NPRL2在CRC組織及外周血中的表達(dá)在CRC的研究中發(fā)現(xiàn)，CRC組織中NPRL2 mRNA和蛋白水平較正常結(jié)腸組織均明顯降低[21]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在腺瘤期NPRL2蛋白表達(dá)已經(jīng)開(kāi)始降低，低分化腫瘤中NPRL2的表達(dá)顯著低于高分化或中分化腫瘤，在CRC中該基因表達(dá)顯著低于腺瘤[21]。結(jié)直腸腫瘤中NPRL2 mRNA表達(dá)隨著腫瘤進(jìn)展和組織學(xué)分級(jí)而降低[21]。血液中NPRL2 mRNA表達(dá)水平與腫瘤組織中NPRL2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。腺瘤患者血液中的NPRL2 mRNA水平明顯低于正常組[21]。綜上，NPRL2與CRC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并且該基因的表達(dá)水平與CRC組織分化程度相關(guān)。在CRC患者中外周血中NPRL2 mRNA水平低于正常人這一發(fā)現(xiàn)提示我們，NPRL2相關(guān)的血清學(xué)檢查有望成為發(fā)現(xiàn)早期CRC的一種手段，但具體的靈敏性和特異性還需進(jìn)一步的研究。

2.2 NPRL2對(duì)CRC的影響

2.2.1 NPRL2通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)而抑制CRC的發(fā)生、發(fā)展：NPRL2作為抑癌基因能有效調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞的細(xì)胞周期，使其受阻于G1期，并抑制CRC細(xì)胞增殖，阻止CRC細(xì)胞侵襲及遷移[22]。這一發(fā)現(xiàn)為NPRL2抑制CRC發(fā)生、發(fā)展提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。

2.2.2 NPRL2促進(jìn)CRC細(xì)胞的凋亡和自噬：細(xì)胞凋亡也被稱(chēng)為細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞停止生長(zhǎng)和分裂，最終進(jìn)入一個(gè)導(dǎo)致細(xì)胞受控死亡的過(guò)程，其內(nèi)容物不會(huì)泄漏到周?chē)h(huán)境中。然而，細(xì)胞凋亡機(jī)制的失控是癌癥的一個(gè)標(biāo)志。細(xì)胞凋亡過(guò)少會(huì)導(dǎo)致在癌組織中觀察到的細(xì)胞不受控制地生長(zhǎng)和分裂[23]。DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可以清除癌前病變中潛在的有害細(xì)胞，從而阻礙腫瘤的生長(zhǎng)。細(xì)胞凋亡的改變不僅與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，還與腫瘤對(duì)治療的耐藥性有關(guān)[24]。

自噬是一個(gè)將細(xì)胞成分如大分子蛋白質(zhì)甚至整個(gè)細(xì)胞器通過(guò)雙膜自噬體結(jié)構(gòu)包裹運(yùn)輸?shù)饺苊阁w降解的過(guò)程。降解產(chǎn)物中的一些成分既可以被循環(huán)利用來(lái)創(chuàng)建新的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器，也可以被進(jìn)一步加工和用作能源以支持代謝和促進(jìn)細(xì)胞存活[23]。自噬過(guò)程是一個(gè)保持細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的重要機(jī)制，其失調(diào)參與了多種疾病發(fā)生，如代謝紊亂、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫改變和癌癥，可以利用自噬來(lái)清除衰老細(xì)胞和破壞腫瘤病變[25]。調(diào)節(jié)自噬被認(rèn)為是一種潛在的治療癌癥的策略。

NPRL2轉(zhuǎn)染的CRC腫瘤細(xì)胞中，抗凋亡因子Bcl-2降低，促凋亡因子Bax、caspase-3、caspase-7升高[22]，進(jìn)一步提示了NPRL2可能通過(guò)促進(jìn)CRC細(xì)胞的凋亡抑制腫瘤進(jìn)展。既往在CRC的研究中發(fā)現(xiàn)，NPRL2基因過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)CRC HT29細(xì)胞的自噬，但這種自噬可以抑制由NPRL2基因引起的凋亡[26]。研究還發(fā)現(xiàn)，NPRL2誘導(dǎo)的CRC HT29的自噬可以被自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞活性降低，增殖被抑制，凋亡被促進(jìn)[26]。NPRL2既能促進(jìn)CRC組織的凋亡，又能促進(jìn)自噬，這提示我們可以通過(guò)基因治療的手段將NPRL2促進(jìn)CRC組織凋亡和自噬的作用效果放大，進(jìn)而抑制CRC的發(fā)生、發(fā)展。

2.2.3 NPRL2與化療藥物共同作用促進(jìn)CRC細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性：5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)多年來(lái)一直是CRC的首選化療藥物，有研究表明，NPRL2過(guò)表達(dá)通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt/mTOR網(wǎng)絡(luò)功能，增強(qiáng)5-FU敏感性，導(dǎo)致CRC細(xì)胞增殖受到抑制，G1細(xì)胞周期阻滯。NPRL2轉(zhuǎn)導(dǎo)和5-FU分別處理CRC細(xì)胞后細(xì)胞凋亡明顯增加。且NPRL2過(guò)表達(dá)和5-FU聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用比單獨(dú)干預(yù)更顯著[27]。有研究表明，NPRL2可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活化等途徑來(lái)增加奧沙利鉑(Oxaliplatin，L-OHP)的治療敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)L-OHP的耐藥性[28]。另外研究發(fā)現(xiàn)，NPRL2過(guò)表達(dá)可通過(guò)激活DNA損傷檢查點(diǎn)途徑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和G2/M細(xì)胞周期阻滯，從而提高伊利替康的敏感性[29]。NPRL2與化療藥物共同作用于CRC促進(jìn)化療藥物對(duì)腫瘤組織的敏感性，促進(jìn)腫瘤組織凋亡，提示我們可以將基因治療和化療藥物聯(lián)合以改善CRC的治療效果。

2.2.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)NPRL2在CRC中的抗腫瘤作用：體外實(shí)驗(yàn)對(duì)于評(píng)估CRC治療的可行性和有效性有一定的局限性，有學(xué)者通過(guò)建立CRC裸鼠異種移植模型證實(shí)了NPRL2在體內(nèi)對(duì)CRC組織的抗腫瘤作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NPRL2轉(zhuǎn)染的腫瘤組織中抗凋亡因子Bcl-2降低，促凋亡因子Bax、caspase-3、caspase-7升高，磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)下調(diào)?；钚越Y(jié)構(gòu)Akt已經(jīng)在人類(lèi)的多種癌癥中被證實(shí)，Akt的不受控制的激活會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)展。這些結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)NPRL2促進(jìn)CRC腫瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致。在CRC體內(nèi)異種移植模型中，NPRL2降低了腫瘤體積和重量，增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡[30]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了NPRL2在CRC中有抑制腫瘤組織進(jìn)展的作用。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證了NPRL2具有增強(qiáng)CRC細(xì)胞對(duì)L-OHP和5-FU敏感性的作用。多重耐藥(multi-drug resistance，MDR)是腫瘤化療失敗的主要原因。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是最具特征的MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是公認(rèn)的腫瘤治療中戰(zhàn)勝M(fèi)DR的靶點(diǎn)[31]。MRPs，特別是多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein 1，MRP1)，促進(jìn)對(duì)化療藥物的耐藥性[32]。NPRL2轉(zhuǎn)染和L-OHP、5-FU處理腫瘤后，P-gp和MRP1的表達(dá)降低，促凋亡因子Bax、caspase-3、caspase-7升高，抗凋亡因子Bcl-2降低[30]。這一結(jié)果表明，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中NPRL2也能降低CRC對(duì)化療藥物的耐藥性，NPRL2聯(lián)合化療藥物可以促進(jìn)CRC細(xì)胞的凋亡。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為NPRL2抑制CRC組織發(fā)生、發(fā)展提供了更有力的證據(jù)。同時(shí)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中將NPRL2裝載進(jìn)慢病毒中，然后通過(guò)靜脈注射的方式將慢病毒導(dǎo)入CRC裸鼠異種移植模型，使其過(guò)表達(dá)NPRL2，這種方法給我們基因治療CRC的方式予以提示。

3 總結(jié)

綜上所述，抑癌基因NPRL2能通過(guò)調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞周期抑制CRC細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展，并且能促進(jìn)CRC細(xì)胞的凋亡和自噬，增強(qiáng)CRC細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的敏感性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，NPRL2通過(guò)調(diào)控凋亡因子和Akt的激活發(fā)揮抗腫瘤作用，并且可以增強(qiáng)CRC細(xì)胞對(duì)L-OHP和5-FU的敏感性。這些結(jié)果提示我們NPRL2基因有望成為CRC新的治療方向，并且將NPRL2與藥物聯(lián)合可以作為CRC新的治療策略。腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制多種多樣，NPRL2基因?qū)τ贑RC的抑制作用或許遠(yuǎn)不止是通過(guò)抑制細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬這幾種方式，探索NPRL2基因抑制CRC進(jìn)展作用的其他方式或通路很有必要。但同時(shí)，由于NPRL2在人體多種正常組織中均有表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)在前列腺癌等組織中NPRL2能促進(jìn)腫瘤組織生長(zhǎng)，因此，要將NPRL2應(yīng)用到CRC的基因治療中，仍有很多問(wèn)題需要解決。