任威瑞， 張 創(chuàng)， 趙文娟， 張宇翔， 王軍民

1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院小兒外科

鋸齒狀息肉(serrated polyp，SP)是一種隱窩上皮存在鋸齒狀形態(tài)結(jié)構(gòu)，具有不同程度惡性潛能的異質(zhì)性病變，其中包括增生性息肉(hyperplastic polyp，HP)、傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma，TSA)和無蒂鋸齒狀腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp，SSA/P)[1]。鋸齒狀息肉病綜合征(serrated polyposis syndrome，SPS)過去被稱為增生性息肉綜合征(hyperplastic polyposis syndrome，HPPS)[2]。Burt和Jass于2000年提出了HPPS定義，被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)可并延續(xù)至今[3]。WHO于2019年更新了診斷標(biāo)準(zhǔn)，SPS的診斷要求滿足以下條件之一：(1)在近端結(jié)腸至少有5枚SP，大小均>5 mm，其中至少有2枚SP直徑>10 mm；(2)在整個(gè)結(jié)直腸腔中發(fā)現(xiàn)超20枚大小不同的SP，其中至少5枚位于近端結(jié)腸[4]。雖然SPS患者有較高的發(fā)展為結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，但SPS遺傳缺陷機(jī)制目前仍不明確[5]。高通量基因芯片和測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展為探索SPS的基因表達(dá)譜、發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)胞在特定狀況狀態(tài)下的基因表達(dá)情況和關(guān)鍵基因變化規(guī)律提供了可能。綜合的生物信息學(xué)分析可以幫助我們進(jìn)一步研究并更好地探索其潛在機(jī)制[6]。為了更深層次研究SPS各種基因變化及引起SPS的關(guān)鍵基因，本研究從Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇了GSE19963數(shù)據(jù)集，下載并分析數(shù)據(jù)以獲取SPS的腸道組織樣本和正常結(jié)腸黏膜組織樣本的差異表達(dá)基因。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集和功能注釋，基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，分析其關(guān)鍵基因，應(yīng)用藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Connectivity Map(CMap)探索具有潛在治療SPS作用的小分子藥物。本研究希望通過生物信息學(xué)為SPS的早期診斷、發(fā)病機(jī)制及治療藥物的研究提供一定依據(jù)和方向。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)來源利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)平臺(tái)下的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.gov/geo/)檢索并下載了SPS相關(guān)的數(shù)據(jù)芯片集GSE19963，其中包含了5個(gè)SPS患者腸道組織樣本和4個(gè)正常結(jié)腸黏膜組織樣本，采用GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix平臺(tái)進(jìn)行差異表達(dá)基因的檢測(cè)。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選利用在線分析程序GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對(duì)SPS組織樣本及對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以調(diào)整P值(adj.P)<0.05和|log2FC|>1為差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 差異表達(dá)基因的功能富集和注釋DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)是一個(gè)整合大量生物數(shù)據(jù)，為候選基因提供功能富集和注釋可視化的在線工具。將篩選出的差異表達(dá)基因映射到DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)注釋，即基因功能富集分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路富集分析，以adj.P<0.05為閾值進(jìn)行篩選。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析利用STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)構(gòu)建SPS差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇置信度>0.4的基因映射到Cytoscape 3.7.1軟件行可視化分析，通過分子復(fù)合物檢測(cè)算法(molecular complex detection，MCODE)行模塊分析，以degree cut-off為10，haircut on，node score cut-off為0.2，max depth為100及k-core為2篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要模塊。使用Cyto Hubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)以度(Degree)來進(jìn)行計(jì)算，所得前5個(gè)基因定為關(guān)鍵基因。

1.5 潛在治療藥物的篩選CMap數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.broad.mit.edu/cmap)是一個(gè)化學(xué)試劑作用表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)[7]，是利用小分子藥物處理人類細(xì)胞后的基因表現(xiàn)差異建立的一個(gè)小分子藥物、基因表現(xiàn)與疾病相互關(guān)聯(lián)的生物應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)。將Cytoscape軟件中MCODE插件及Cyto Hubba插件所得的模塊基因及關(guān)鍵基因映射到CMap數(shù)據(jù)庫(kù)上，將結(jié)果按照關(guān)聯(lián)系數(shù)評(píng)分大小篩選出負(fù)相關(guān)中排名前10位的小分子藥物。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選的結(jié)果將GSE19963數(shù)據(jù)集中4個(gè)正常的結(jié)腸黏膜組織樣本作為空白組，5個(gè)SPS患者腸道組織樣本作為對(duì)照組，共獲得230個(gè)差異表達(dá)基因，其中157個(gè)為上調(diào)基因，73個(gè)為下調(diào)基因。

2.2 差異表達(dá)基因的功能富集和注釋通過DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋及KEGG信號(hào)通路富集分析以明確基因功能。GO注釋主要包括生物過程(biological processes，BP)、細(xì)胞組成(cellular components，CC)和分子功能(molecular functions，MF)三個(gè)部分。在BP中，上調(diào)基因主要富集于細(xì)胞間粘附、氧化還原、甘油三酸酯的生物合成、對(duì)有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、肌動(dòng)蛋白絲束組件、膽固醇生物合成等過程中，下調(diào)基因主要富集于細(xì)胞對(duì)鋅離子的反應(yīng)、生長(zhǎng)負(fù)調(diào)節(jié)、碳酸氫鹽運(yùn)輸、氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等過程中。在CC中，上調(diào)基因主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細(xì)胞外泌體、細(xì)胞間粘附、細(xì)胞膜錨定成分、細(xì)胞外成分中，下調(diào)基因主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細(xì)胞膜錨定成分、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域中。在MF中，上調(diào)基因主要富集于氧化還原酶活性、鈣黏著蛋白結(jié)合參與細(xì)胞粘附、鈣離子結(jié)合、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列結(jié)合及透明質(zhì)酸氨基葡萄糖苷酶活性中，下調(diào)基因主要富集于碳酸酐酶活性、鋅依賴的乙醇脫氫酶活性、鉀通道調(diào)節(jié)劑活性及金屬離子的結(jié)合。KEGG信號(hào)通路富集發(fā)現(xiàn)，上調(diào)基因主要富集類固醇的生物合成、抗生素的生物合成、新陳代謝通路、ECM受體相互作用等通路，下調(diào)基因主要富集于礦物質(zhì)吸入、藥物代謝-細(xì)胞色素P450途徑、化學(xué)物質(zhì)致癌等通路中(見圖1)。

圖1 功能與通路富集分析結(jié)果 A：上調(diào)基因；B：下調(diào)基因Fig 1 Function and pathway enrichment analysis results A: up-reglated genes; B: down-reglated genes

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析通過STRING11.0在線工具和Cytoscape 3.7.1對(duì)655個(gè)差異基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，去除游離的蛋白影響后，得到了如圖2所示的網(wǎng)絡(luò)。用MCODE插件對(duì)其中重要的模塊分析后得到排名前2的集群模塊，其得分分別為7.714、4.533(見圖3A～3B)。模塊1主要為上調(diào)基因：MUC5AC、MSLN、CEACAM6、LCN2、TFF1、TFF2、PSCA、SERPINB5，功能注釋發(fā)現(xiàn)模塊1與消化功能相關(guān)。模塊2主要為下調(diào)基因：PYY、UGT2B15、GUCA2A、PRKAA2、PCSK9、PNPLA3、CLDN2、NQO1、INSIG1、SULT1C2、FPR2、NPY1R、PLA2G12B、ADRA1A、UGT2A3、ADCYAP1，功能注釋與富集發(fā)現(xiàn)模塊2與葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化、神經(jīng)肽激素活性等功能有關(guān)(見表1)。通過Cyto Hubba插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析得到5個(gè)關(guān)鍵基因：GCG、LCN2、TFF1、SCD、SERPINB5(見圖3C)。

注：紅色節(jié)點(diǎn)表示上調(diào)的差異表達(dá)基因，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示下調(diào)的差異表達(dá)基因，連接的線段表示節(jié)點(diǎn)間的相互調(diào)節(jié)。圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)

注：紅色節(jié)點(diǎn)表示上調(diào)的差異表達(dá)基因，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示下調(diào)的差異表達(dá)基因，連接的線段表示節(jié)點(diǎn)間的相互調(diào)節(jié)。圖3 重點(diǎn)蛋白表達(dá)模塊 A：蛋白質(zhì)表達(dá)模塊1；B：蛋白質(zhì)表達(dá)模塊2；C：Cyto Hubba表達(dá)關(guān)鍵蛋白

表1 模塊基因的功能與通路富集分析Tab 1 Function and pathway enrichment analysis results in expression modules

2.4 潛在治療藥物的篩選在CMap數(shù)據(jù)庫(kù)中，處于-1～1的關(guān)聯(lián)系數(shù)評(píng)分(score)是重要參數(shù)，其絕對(duì)值越大表明相關(guān)性越大。正值表示藥物擾動(dòng)的表達(dá)譜與疾病擾動(dòng)的表達(dá)譜正相關(guān)，負(fù)值表示藥物擾動(dòng)的表達(dá)譜與疾病擾動(dòng)的表達(dá)譜負(fù)相關(guān)，可以簡(jiǎn)單地認(rèn)為藥物能夠減輕甚至逆轉(zhuǎn)該疾病狀態(tài)。將模塊基因及關(guān)鍵基因映射到CMap數(shù)據(jù)庫(kù)上，score排名前10的小分子化合物如表2所示，這些小分子藥物是潛在治療SPS作用的小分子化合物。

表2 前10個(gè)具有潛在治療SPS的小分子藥物Tab 2 Top 10 small molecule drugs with potential for treating SPS

3 討論

糞便潛血試驗(yàn)或糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)陽性的患者行結(jié)腸鏡檢查，SPS的發(fā)現(xiàn)率為0.09%～0.4%[8]。SPS和結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)，相關(guān)研究報(bào)道SPS患者中結(jié)直腸癌的患病率為15.8%～29.3%[9-10]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)SPS的研究較少，相關(guān)研究處于起始階段，其分子機(jī)制仍不明確[11-12]。生物信息是一門新興的學(xué)科，已被廣泛應(yīng)用于高通量芯片、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等大數(shù)據(jù)分析中，在探索相關(guān)疾病新的診療靶標(biāo)以及新藥研發(fā)中具有重要意義[13]。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載SPS GSE19963芯片數(shù)據(jù)集，通過生物信息學(xué)篩選出了230個(gè)差異表達(dá)基因，其中157個(gè)為上調(diào)基因，73個(gè)為下調(diào)基因。上調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集于細(xì)胞間粘附、脂類物質(zhì)的生物合成、氧化還原及類固醇的生物合成等過程。下調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集于金屬離子的結(jié)合、礦物質(zhì)吸收、碳酸酐酶活性及細(xì)胞色素P450途徑等過程。這些過程主要涉及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝途徑、外源物質(zhì)的代謝及氧化還原反應(yīng)等。強(qiáng)有力的流行病學(xué)證據(jù)表明，飲食差異及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收代謝是腸道息肉及結(jié)直腸癌發(fā)病率變化的主要決定因素，這與我們研究的差異表達(dá)基因的功能富集相吻合[14]。腸道是人體重要的代謝器官，腸道功能受損影響細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的失衡，可直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)生物分子損傷和炎癥的發(fā)生，相關(guān)通路與SPS的發(fā)生可能有關(guān)[15]。為了研究SPS發(fā)生的分子機(jī)制，我們對(duì)差異基因進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析，并利用Cyto Hubba插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，獲得了5個(gè)關(guān)鍵基因： GCG、LCN2、TFF1、SCD、SERPINB5。其中，GCG主要產(chǎn)生許多眾所周知的激素，例如胰高血糖素、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)和高血糖素樣肽2(GLP-2)等，這些高血糖素原衍生肽在葡萄糖和能量平衡中起著非常重要的作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1通過成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7(Fgf7)調(diào)節(jié)腸道生長(zhǎng)，促進(jìn)息肉及腫瘤的發(fā)生[17]。但目前尚無關(guān)于GCG在SPS中的臨床價(jià)值的報(bào)道，值得進(jìn)一步研究。LCN2編碼屬于脂蛋白家族的蛋白質(zhì)，該家族成員主要運(yùn)輸小疏水分子，如脂類、類固醇激素和維甲酸類物質(zhì)，在各種類型的腫瘤發(fā)生與發(fā)展中起重要作用。LCN2通過改變結(jié)直腸癌中代謝基因的表達(dá)水平調(diào)控細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，是結(jié)直腸癌潛在的治療靶標(biāo)[17]，然而，LCN2在SPS的表達(dá)模式和功能作用仍然知之甚少，也值得進(jìn)一步研究。TFF1所屬的TFF家族主要在正常胃黏膜及受損的胃腸道組織中表達(dá)，一方面，TFF1通過延遲G1-S期轉(zhuǎn)變降低胃腸道細(xì)胞增殖，另一方面TFF1可以保護(hù)化學(xué)物質(zhì)所造成的腸道細(xì)胞的凋亡[18]。TFF1的抗增殖及抗凋亡的雙重特性及其在SPS的作用值得進(jìn)一步研究。SCD編碼參與脂肪酸生物合成的酶，其基因編碼的蛋白屬于脂肪酸去飽和酶家族，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。微粒體硬脂酰CoA去飽和酶(SCD1)在調(diào)節(jié)飽和脂肪酸(硬脂酸酯和棕櫚酸酯)的作用中起關(guān)鍵作用。這些脂肪酸具有很強(qiáng)的脂毒性潛力，可引起炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素抵抗而促進(jìn)腸道炎癥的發(fā)生,這可能與SCD在SPS發(fā)生中的作用有關(guān)[19]。SERPINB5又名Maspin，突變的Maspin會(huì)使部分腫瘤抑制功能喪失，降低對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性并促進(jìn)細(xì)胞的惡性進(jìn)展。最為重要的是，Maspin在正常黏膜中不表達(dá)，有研究建議可將其作為SP的標(biāo)志基因，其是否可作為SPS的標(biāo)志基因需通過一系列實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證[20]。本研究也通過CMap數(shù)據(jù)庫(kù)篩選了潛在治療SPS的化合物，其中吡咯酰胺為血小板聚集抑制劑，有研究報(bào)道，其可減輕腸道炎癥[21]，有可能成為治療SPS的小分子藥物。大量研究已證實(shí)，槲皮素具有預(yù)防結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的作用，且有文獻(xiàn)報(bào)道，其可減少家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者腸道腺瘤的數(shù)量和大小，其對(duì)SPS的治療作用需進(jìn)一步研究[22-23]。胡椒堿是一種衍生自黑胡椒的生物堿前體藥物，相關(guān)研究表明其具有預(yù)防結(jié)腸癌的作用，并可增強(qiáng)姜黃素的抗腫瘤能力，有可能成為治療SPS的小分子藥物[24-25]。

綜上所述，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析從GSE19963數(shù)據(jù)集確定了230個(gè)差異表達(dá)基因并進(jìn)行了基因的GO功能富集分析及KEGG信號(hào)通路分析，我們發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要富集于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝途徑、外源物質(zhì)的代謝及氧化還原反應(yīng)等過程。本研究還發(fā)現(xiàn)一些新的在SPS發(fā)展中起著核心作用的基因及潛在的治療SPS的小分子藥物，如新型基因GCG、LCN2、TFF1、SCD及吡咯酰胺、槲皮素、胡椒堿等小分子藥物。這些均為SPS的診斷與治療提供了潛在的標(biāo)志物及靶標(biāo)?？紤]到本研究有一定的局限性，這些預(yù)測(cè)需通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。