袁通闊，張紅國，尹煥才，劉睿智，殷 建

(1.上海大學生命科學學院，中國 上海 200444；2.中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所，中國 蘇州 215163；3.吉林大學白求恩第一醫(yī)院，中國 長春 130021)

由于環(huán)境惡化、晚婚晚育以及工作壓力的日益增大，我國男性不育癥的比例不斷上升[1]。據(jù)《2015—2017年中國不孕不育醫(yī)院行業(yè)現(xiàn)狀研究分析及市場前景預測報告》顯示，我國男性不育癥患者數(shù)量已達1 200萬，這些患者亟需病因分析及針對性治療。Y染色體微缺失是15%以上男性不育癥的主要來源，其引發(fā)的原發(fā)性無精子和少精子癥不僅難以治愈，且可隨輔助生殖技術傳遞給下一代，進而引發(fā)新的不育癥，因而受到研究者及臨床醫(yī)生的日益關注[2]。

Y染色體微缺失主要指染色體長臂上的無精子因子(azoospermia factor，AZF)區(qū)域的缺失[3]。AZF區(qū)可分為3個區(qū)域，即AZFa，AZFb及AZFc區(qū)[4]，每個區(qū)域都包含幾個調(diào)控精子形成的關鍵基因，這些基因的缺失或突變均可能導致少精或無精[5,6]。其中，AZFa區(qū)域的缺失幾率較低，但其喪失將導致絕對無精子癥，因此AZFa區(qū)域缺失的患者不建議做單精子胞漿內(nèi)注射手術(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)[7]。AZFb區(qū)域缺失的患者表現(xiàn)為生精阻滯，精子生成被阻滯在精母細胞階段，導致沒有精子生成，患者即使進行睪丸穿刺也不能獲得精子，因此對于該類患者不建議做 ICSI[8]。AZFc區(qū)缺失較為常見，是精子形成障礙的重要原因之一[9-11]。AZFc區(qū)域缺失的患者尚存精子生成能力，因此可以通過輔助生育手段進行治療，這一治療會將AZFc區(qū)域缺失遺傳給男性后代[12]?？梢姡琘染色體微缺失檢測對男性在生殖遺傳學方面的臨床治療、提高輔助生殖的療效和安全性以及開展胚胎植入前的遺傳學診斷均具有重要意義[13]。

經(jīng)過長期探索，歐洲男科協(xié)會(European Academy of Andrology，EAA)和歐洲分子遺傳質量協(xié)作網(wǎng)(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)聯(lián)合發(fā)布了Y染色體微缺失的檢測指南[14]。指南建議，臨床醫(yī)生可通過對AZFa，AZFb和AZFc 3個區(qū)域的sY84，sY86，sY127，sY134，sY254和sY255共6個序列標簽位點(sequence tagged site，STS)進行多重PCR凝膠電泳或者熒光定量PCR(qPCR)檢測，進而診斷3個區(qū)域微缺失的狀況。2015 年我國男性生殖遺傳學檢查專家達成共識，建議對非梗阻性無精子癥以及嚴重的少精子癥患者進行Y染色體微缺失檢測[15]，并延用了歐洲男科協(xié)會指南中的方法[16-18]。但這些方法仍存在問題，其中凝膠電泳檢測靈敏度不足且易受干擾；qPCR準確度較高，但其結果依賴于閾值范圍內(nèi)的主觀判斷，因此當臨床樣本中DNA質量較差及條件非優(yōu)化的情況下，可能出現(xiàn)假陰性，這一缺陷在DNA病毒及其他檢測中極為常見[19]。與此同時，Y染色體微缺失僅為約15%的男性不育癥來源，對于多數(shù)患者而言，其病因依然未知[20]。隨著男性不育癥遺傳因素研究的深入，miRNA[21]、游離DNA[22]、DNA甲基化[23]及融合突變[24]等均被發(fā)現(xiàn)與男性不育癥相關，但尚未建立統(tǒng)一的標準和檢測方法。除此之外，這些新的因素往往豐度較低，不易檢測，因此更需要靈敏且準確度高的檢測方法。

數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)技術是在20世紀末，由Vogelstein等人提出的一種高靈敏度的核酸檢測方法[25]。其通過將一個PCR反應分配到多個微小的反應微滴當中，使每個微滴中包含一個或多個拷貝的DNA模板，從而實現(xiàn)單分子條件下的PCR擴增。擴增結束后，通過計算陽性與陰性的微滴個數(shù)比例進行統(tǒng)計學分析[26]。與其他分子檢測技術相比，dPCR具有靈敏度高、特異性強、樣本需量低以及成本與qPCR相似的優(yōu)勢[27]。然而，該技術是否能夠用于Y染色體微缺失和其他輔助生殖相關的檢測尚有待于驗證。

有鑒于此，本文擬以dPCR技術為基礎，開發(fā)Y染色體微缺失的新型檢測方法并進行優(yōu)化。通過與醫(yī)院已知缺失類型的臨床樣本進行對比，驗證dPCR方法的靈敏度與準確性，據(jù)此考察dPCR技術在生殖健康領域的應用可行性，并為下一步新型臨床檢測方案的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Y染色體微缺失檢測試劑盒(PCR熒光探針法；PG07001Y4，透景生命科技股份有限公司)；TB Green-qPCR試劑盒(RR820A，TaKaRa公司)；QX200 dPCR EvaGreen染料法預混液(186-4033)和QX200 染料法微滴生成油(186-4006)購自BIO-RAD公司；去離子水(A500197-0500)、6×載樣緩沖液(B540084)及DNA分子標準Maker S(B610003)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 DNA檢測

已知Y染色體微缺失類型的DNA標準品由透景公司提供，并已通過透景試劑盒驗證其缺失類型。DNA濃度采用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific公司，美國)進行檢測(表1)，之后將樣本稀釋至10 mg·L-1，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 6例樣本濃度及其260 nm吸光度(optical density，OD260)/OD280值

1.3 引物選擇及驗證

1.3.1 引物選擇 所采用引物見表2，獲自歐洲男科協(xié)會發(fā)布的Y染色體微缺失檢測指南。

1.3.2 引物驗證 采用TB Green-qPCR試劑盒對正常男性DNA樣本和AZF全缺失的男性DNA樣本進行檢測，驗證引物有效性。首先，配置PCR反應體系，包括TB Green 預混液(2×)10 μL、PCR 正向引物(10 μmol·L-1)和PCR 反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL、ROX 染料(50×)0.4 μL、DNA模板2 μL及雙蒸水6 μL。之后置于ABI 7500 PCR儀(Applied Biosystems 公司，美國)中進行擴增和PCR檢測。其程序設置為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 34 s(32個循環(huán))。

表2 引物序列表

1.4 試劑盒性能測試

1.4.1 檢測限對比 由于市售透景試劑盒的推薦樣本質量濃度為10 mg·L-1，筆者將正常男性與AZF全缺失病人DNA樣本用去離子水梯度稀釋至10,1,0.1,0.01 mg·L-1，分別采用透景試劑盒及dPCR試劑盒進行檢測，確定其各自的檢測限。透景試劑盒PCR操作流程如1.3.2。dPCR反應體系為：QX200 dPCR EvaGreen染料法預混液 10 μL；正向引物(10 μmol·L-1) 0.4 μL；反向引物(10 μmol·L-1) 0.4 μL；DNA模板 2 μL；加去離子水補齊至20 μL。反應體系震蕩混勻后加入到微滴生成板中間，每孔20 μL，加入過程中避免氣泡產(chǎn)生。微滴生成板底部孔中加入70 μL微滴生成油后，用微滴生成儀(QX200，BIO-RAD公司，美國)生成微滴，緩慢取出微滴至PCR反應管中，在PCR擴增儀(Mastercycler nexus，Eppendorf公司，美國)中擴增，程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min(32個循環(huán))，4 ℃ 5 min；90 ℃ 5 min；4 ℃保溫。擴增結束后使用微滴讀數(shù)儀(QX200，BIO-RAD公司，美國)進行檢測。

1.4.2 準確性檢測 對模板為0.1 mg·L-1的不同缺失類型臨床樣本(經(jīng)透景試劑盒驗證，具體結果不列出)，應用dPCR試劑盒進行檢測，流程同1.4.1。

1.5 引物二聚體檢測

由于在應用dPCR進行檢測的過程中，sY84及sY255樣本出現(xiàn)了假陽性，為此對擴增后的產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。具體過程為：取5 μL 反應產(chǎn)物與1 μL 6×載樣緩沖液混勻后上樣，120 V電壓下電泳25 min。之后，采用凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ，BIO-RAD公司，美國)拍照。

1.6 退火溫度優(yōu)化

為減少二聚體的生成，針對sY84和sY255位點，測定不同退火溫度對反應體系的影響，在同一實驗條件下，分別采用56,58,60,62 ℃的退火溫度進行PCR擴增，其余操作及循環(huán)步驟同1.4.1。

1.7 臨床樣本的檢測

為進一步確定dPCR檢測方法的準確性，對吉林大學白求恩第一醫(yī)院生殖中心提供的已知缺失類型和正常男性的臨床樣本27例進行檢測，檢測方法同1.4.1。

1.8 統(tǒng)計學方法

表3 qPCR試劑盒檢測結果

本文中的結果均為3次不同批次樣品結果的平均值(n=3)，采用SPSS 14.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用方差分析法比較每組間的結果，LSD法進一步對比。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 引物驗證

應用Y染色體微缺失的檢測指南推薦引物，對正常男性DNA樣本和AZFa, AZFb及AZFc全缺失的男性DNA樣本進行檢測。結果顯示，正常男性的DNA樣本可正常檢測到6個位點的基因表達，而全缺失的DNA樣本無法檢測到任何基因表達(表3)，表明引物可用。

2.2 qPCR檢測限的測定

采用透景試劑盒，筆者對梯度濃度的正常男性DNA樣本進行檢測。如圖1所示，隨著樣本DNA濃度的下降，目的基因的CT值增加。當模板DNA質量濃度降至0.1 mg·L-1以下時，沒有明顯的熒光曲線變化。因此可知，qPCR檢測下限為1 mg·L-1。

圖1 qPCR檢測正常男性DNA樣本結果

2.3 dPCR檢測限測定

同樣濃度的正常男性DNA樣本采用dPCR試劑盒進行檢測，結果表明，質量濃度為0.01 mg·L-1時，sY14和sY134位點沒有檢測到陽性值(如圖2所示)，即dPCR檢測Y染色體微缺失的最低樣本濃度為0.1 mg·L-1?？梢姡琩PCR較qPCR 具有更高的靈敏度。

2.4 假陽性檢測結果

在應用同樣的引物及數(shù)字PCR技術進行全缺失樣本(樣本DNA為0.1 mg·L-1)檢測時，sY84和sY255位點出現(xiàn)了假陽性(如圖3)。對擴增后的全缺失樣本產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，條帶大小均為50 bp左右(如圖4)。鑒于條帶較寬及微弱，且溶解曲線峰出現(xiàn)于80 ℃前，推測其可能為引物二聚體，并由于太小而易于在高溫下降解[28]。

圖2 sY14，sY84，sY86，sY127, sY134, sY254及sY255位點的梯度檢測結果Fig. 2 Detection of sY14， sY84， sY86， sY127, sY134, sY254 and sY255 locus with gradient concentrations

圖3 dPCR檢測AZF全缺失男性DNA樣本的結果 Fig. 3 dPCR results of DNA samples from males with completely lost AZF

2.5 退火溫度優(yōu)化

為消除引物二聚體的影響，針對sY84和sY255引物進行退火溫度優(yōu)化。結果顯示sY84引物的最佳退火溫度為58 ℃；sY255引物的最佳退火溫度為62 ℃(如圖5)。在該溫度下檢測可有效消除假陽性結果。

2.6 不同缺失類型臨床樣本測試

應用不同缺失類型及正常男性的臨床樣本進行dPCR檢測，結果如圖6所示，檢測結果與醫(yī)院提供的qPCR檢測結果一致。筆者又對吉林大學白求恩第一醫(yī)院生殖中心的27例已經(jīng)確認缺失類型的臨床樣本進行測試，結果如表4，檢測結果與已知樣本缺失一致，證明方法開發(fā)成功。

圖4 全缺失樣本經(jīng)擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖(A)及擴增過程中的熔解曲線的正常溶解曲線和二聚體溶解曲線對比(B: sY84；C: sY255)Fig. 4 Agarose gel electrophoresis detection of samples with completely-deleted AZF zone after amplification and the melting curve during amplification

圖5 sY84和sY255位點的退火溫度優(yōu)化結果Fig. 5 Results of annealing temperature optimization at sY84 and sY255 site

圖6 dPCR檢測結果：AZFa位點缺失(A)；AZFb位點缺失(B)；AZFc位點缺失(C)；AZFb和AZFc位點缺失(D)；AZFa, AZFb及AZFc位點全缺失(E)；正常男性樣本(F)Fig. 6 Results of dPCR detection: AZFa site missing(A); AZFb site missing(B); AZFc site missing(C); Both AZFb and AZFc site missing(D); AZFa, AZFb and AZFc site completely missing(E); Normal male sample(F)

2.7 低豐度臨床樣本檢測

在檢測過程中，筆者發(fā)現(xiàn)一例AZFc區(qū)域原始拷貝數(shù)遠低于AZFa和AZFb的DNA樣本，這可能是由于DNA提取質量較差。分別采用dPCR技術與透景試劑盒對其進行檢測，檢測結果如圖7所示，AZFc區(qū)域的CT值已接近試劑盒給出的閾值(32)，因而給病情診斷帶來了不便。相對而言，dPCR精確地給出了該區(qū)域的原始拷貝數(shù)，可很好地用于判斷Y染色體是否缺失。

3 討論

當今社會，隨著生殖疾病的日趨嚴重及人民群眾對生殖健康關注度的上升，臨床上對于生殖健康領域的遺傳因素分析及檢測技術開發(fā)日益增強。dPCR作為一種絕對定量、靈敏度高且成本較低的檢測技術，已被廣泛用于科學研究中[29-31]，但其在臨床上，特別是生殖健康及輔助生殖領域中的應用仍較為少見。有鑒于此，本文以男性不育癥檢測中常用的Y染色體微缺失為檢測目標，驗證dPCR技術在相關領域中應用的可行性。

表4 臨床樣本檢測結果

圖7 AZFc原始拷貝數(shù)較低樣本的qPCR(A)及dPCR(B)檢測結果Fig. 7 qPCR (A) and dPCR (B) results of a sample with low copy numbers of AZFc

本實驗結果表明，dPCR技術可用于Y染色體微缺失檢測，準確度與qPCR相當，且其靈敏度最低可達到0.1 mg·L-1，為qPCR的1/10，這一結果與文獻報道一致，表明dPCR在低豐度樣本檢測中的可行性[32]。Y染色體微缺失的檢測方法經(jīng)長期探索已較為成熟，并依賴于qPCR技術及PCR電泳技術，但這兩種方法的結果分析主觀性較強。當臨床樣本質量較差、受到污染或PCR條件非最優(yōu)時，可能出現(xiàn)漏檢情況(如圖7)。在此情況下，dPCR因其檢測靈敏度高、分析過程自動化程度高、熒光信號結果判定簡單，減少了因人工操作產(chǎn)生的誤差和交叉污染，具有良好的應用前景[33]。但本文實驗結果也表明，數(shù)字PCR技術的高靈敏性也可能導致微小誤差的放大，因此不能直接沿用qPCR條件，仍需進行具體分析及優(yōu)化。

進一步地，約30%的男性不育癥患者是由遺傳因素造成的，但Y染色體缺失僅為這些遺傳因素中的一部分，這意味著大多數(shù)患者都無法獲得明確的診斷，因而導致藥物無效及反復治療。有鑒于此，研究者針對可能與男性不育癥相關的遺傳信息進行研究，并發(fā)現(xiàn)為數(shù)眾多的遺傳因素，包括DNA甲基化、外周血游離DNA、miRNA以及嵌合型突變等多種因素均可能與男性不育癥相關。但這些因素往往豐度較低，且易于受到污染，因此到目前為止，尚未有除Y染色體微缺失之外的檢測指標進入臨床。這一方面說明臨床上的理論研究仍不足；另一方面也說明有待于開發(fā)更靈敏及準確的檢測方法?；驕y序及基因芯片等技術已被用于新靶點篩選及檢測，并被證明其準確性與靈敏度高于現(xiàn)有的qPCR技術[34,35]，然而由于成本較高，不適于臨床檢測。有鑒于此，具有與上述方法靈敏度相當?shù)杀撅@著降低的dPCR技術具有更大的應用前景。

隨著男性不育癥問題的加劇，對其進行遺傳學檢測從而揭示病因及確定療法成為個性化治療的必需。因此，基于dPCR技術，開發(fā)新的檢測位點與方法，并建立與臨床病癥的相關性，將成為輔助生殖領域的重要支撐技術。