程鐵轅

（成都海關技術中心宜賓分部國家酒類檢測重點實驗室，四川宜賓 644000）

當前，在白酒微觀形態(tài)觀測等領域，主要應用的觀測儀器有原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy，AFM）等，其中，原子力顯微鏡在液體樣品微觀觀測方面存在一個很大的不足之處，需要在無塵臺上自然風干后方可用于顯微鏡觀察[1]，致使白酒中大多數揮發(fā)性微量成分無法被觀測到，損失了大量重要的樣品信息，因此，該方法僅能觀測到白酒樣品中部分信息。冷凍電子顯微鏡技術（cryo-electron microscopy）簡稱冷凍電鏡，近年來，隨著樣品制備觀測等技術[2-3]的持續(xù)進步以及冷凍電鏡軟硬件[4-5]的改進，冷凍電鏡技術獲得了飛躍式發(fā)展[6]，其在生物大分子復合體和細胞（細胞器）超微結構觀測方面的技術優(yōu)勢，極大地推動了結構生物學的飛速發(fā)展。相較于其他技術，冷凍電鏡技術具有一個重要優(yōu)勢，即樣品經過低溫冷凍后，能夠最大限度地保存樣品中包含的信息。冷凍電鏡成像獲取的照片信息，需要結合圖像分析技術才能挖掘出更多的有價值信息，卷積神經網絡（Convolutional Neural Network，CNN）作為一種前饋型的神經網絡，是目前深度學習技術領域中極具代表性的神經網絡之一，近年來，在圖像分析和處理領域取得了一系列突破性的研究成果[7-8]，卷積神經網絡具有強大的特征學習與分類能力，在圖像分類等領域具有重要的應用價值，其特點是不需要針對具體特征，即可實現特征提取的封裝。當前，透射電鏡技術在晶體結構觀測上應用廣泛[9-10]，卷積神經網絡應用于中藥材等顯微特征圖像識別研究方面[11]已有相關報道，本研究主要采用冷凍透射電子顯微鏡技術，擬將冷凍電鏡技術與深度學習技術進行結合，通過卷積神經網絡對白酒樣品的冷凍電鏡成像照片信息進行鑒別分類，以期為白酒微觀形態(tài)觀測等領域提供一種全新的研究思路和分析視角，本文將冷凍電鏡技術與深度學習技術相結合的應用，主要針對國內市場上普遍存在的白酒摻假實際，但該技術在白酒及液體食品中的應用范圍絕不會僅限于此，未來，該技術應該會在白酒微觀形態(tài)基礎研究、白酒酒質評價研究、白酒年份酒研究、白酒產地追溯研究、白酒摻假鑒別研究及液體食品相關研究等多個領域具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

試驗樣：購自川南某白酒企業(yè)固態(tài)發(fā)酵法原酒（樣品編號為1#—5#），購自國內市場的某類別摻假白酒（樣品編號為6#、8#），購自國內市場的四川某知名白酒企業(yè)的高端成品酒（樣品編號為7#、9#、10#），其中，1#：2009 年產一級原酒；2#：2018 年產一級原酒；3#：2018 年產優(yōu)級原酒；4#：2019 年產一級原酒；5#：2019 年產優(yōu)級原酒；6#：摻假白酒a；7#：成品酒a；8#：摻假白酒b；9#：成品酒b；10#：成品酒c。

儀器設備：200 kV 冷凍透射電子顯微鏡（浙江大學冷凍電鏡中心），儀器型號：Talos F200C 200 kV（荷蘭FEI 公司）。儀器性能：加速電壓為20～200 kV 高壓，場發(fā)射電子槍；點分辨率≤0.3 nm；信息分辨極限0.15 nm；低溫樣品臺（可傾轉70 度）；配置Ceta 4 k×4 k 相機；安裝EPU 和FEI Xplore3D數據收集軟件。

1.2 實驗方法

將2.5 μL 白酒樣品置于銅網（Quantifoil R1.2/1.3）上，通過vitrobot和液態(tài)乙烷將溶劑迅速冷凍成玻璃態(tài)，在配備有Ceta 4 k×4 k 相機的透射電子顯微鏡（Talos F200C）上，進行冷凍電鏡成像，選取36000×、73000×、120000×3種標稱的放大倍數。

1.3 數據處理軟件

采用Matlab 2019a進行數據處理。

2 結果與討論

2.1 實驗結果

2.1.1 原酒微觀形態(tài)

圖1 為2#樣品36000 倍的觀測圖像，多個圖像中的圓形輪廓是載網1.2/1.3 的孔，由于碳膜上襯度差，一般觀測時只觀測圓形輪廓內部的圖像，圖2為2#樣品73000 倍的觀測圖像，圖3 為2#樣品120000 倍的觀測圖像，圖4 為3#樣品120000 倍的觀測圖像。3 種放大倍數圖像之間的差異，除了與放大倍數有關外，還應該與酒體中存在一些懸浮顆粒有關。如圖所示，深色物質為白酒樣品中觀測的目標物質，從微觀形態(tài)上看，一部分目標物呈圓球狀形態(tài)，一部分目標物呈鏈狀形態(tài)，圓球狀形態(tài)物質在空間觀測上會有重疊，兩種形態(tài)物質在空間上的分布都相對較為均勻。

2.1.2 摻假白酒微觀形態(tài)

圖5 為6#樣品36000 倍的觀測圖像，圖6 為6#樣品73000 倍的觀測圖像，圖7 為6#樣品120000 倍的觀測圖像，圖8為6#樣品73000倍的觀測圖像，均為摻假白酒的微觀形態(tài)圖，從微觀形態(tài)上看，與原酒微觀形態(tài)圖類似，同樣存在一些體積相對較大的圓球狀形態(tài)物質和一些體積相對較小的鏈狀形態(tài)物質，鏈狀形態(tài)物質的分布較為均勻，而圓球狀形態(tài)物質分布相對不均。

圖1 2#樣品圖（36000×）

圖2 2#樣品圖（73000×）

圖3 2#樣品圖（120000×）

圖4 3#樣品圖（120000×）

圖5 6#樣品圖（36000×）

圖6 6#樣品圖（73000×）

圖7 6#樣品圖（120000×）

2.1.3 成品酒微觀形態(tài)

圖9 為7#樣品36000 倍的觀測圖像，圖10 為7#樣品73000 倍的觀測圖像，圖11 為7#樣品120000倍的觀測圖像，圖12 為9#樣品36000 倍的觀測圖像。直觀來看，同樣分布了一些體積相對較大的圓球狀形態(tài)物質和一些體積相對較小的鏈狀形態(tài)物質，與圓球狀形態(tài)物質相比，鏈狀形態(tài)物質的數量更多，分布也更加密集均勻。

圖8 8#樣品圖（73000×）

圖9 7#樣品圖（36000×）

圖10 7#樣品圖（73000×）

2.2 數據處理

從顯微鏡的照片信息來看，不同類型的白酒樣品在圖像信息上的差異，很難通過肉眼觀察而成功的辨識區(qū)分，因此，考慮采用深度學習算法輔助區(qū)分，提高識別自動化效率，實現過程為先按照樣品類型將冷凍電鏡圖片進行分類，本文共分為3 類，然后采用深度學習算法進行訓練預測。本文采用卷積神經網絡，對白酒樣品的冷凍電鏡成像照片進行鑒別分類時，相對而言，放大73000 倍和120000倍的圖像較為清晰，同時，由于采集圖像信息時，采集的73000 倍的圖像數據更為完整，因此，統(tǒng)一選取各白酒樣品的73000 倍的放大倍數進行數據處理，若采集的120000 倍的圖像數據完整，也可用于數據處理。

圖11 7#樣品圖（120000×）

圖12 9#樣品圖（36000×）

2.2.1 面向白酒微觀圖像識別卷積神經網絡的構建

當前，基于CNN 的網絡結構主要有LeNet-5、AlexNet、CaffeNet、GoogleNet、DenseNet、VGG、ResNet、MobileNetV2 等，其中，AlexNet、CaffeNet等網絡結構相對復雜，太冗雜，需要大量的時間和較高的硬件配置去訓練網絡結構，且實測結果通常不佳。限于篇幅，本文主要采用LeNet-5、ResNet50、VGG16、GoogLeNet 等網絡結構，對其進行微調改進后構造白酒微觀圖像分類識別器。

圖13 圖像處理結果圖

（1）LeNet-5 網絡結構在白酒微觀圖像識別中存在的問題及改進方法。LeNet-5作為較為小型的CNN 網絡結構，最早應用于數字圖像的分類識別，原始的LeNet-5 網絡結構主要是針對0～9 共10 個數字圖像分類進行設計，其輸入圖像大小為32*32，數字圖像較為簡單。本研究中，LeNet-5 網絡結構在白酒微觀圖像識別中主要存在的問題為：由于白酒微觀圖像與數字圖像的復雜程度差異較大，所需識別的類型數目也不一致，需要對各層網絡結構參數做進一步的研究。針對上述問題，經實驗研究后，主要改進如下：①增加了ReLU 激活函數：由于ReLU是一種分段線性函數，其具有計算求導簡單，能夠避免深層網絡結構中發(fā)生梯度發(fā)散的現象，因此，用來替代傳統(tǒng)的tanh 和sigmoid 激活函數；②輸出層由10個神經元改成3個神經元。

（2）VGG16、ResNet50、GoogLeNet 等網絡結構的改進。VGG 網絡結構是輸入層為224*224*3，輸出層是對應的1000 個物體類別，本研究中類別為3類，因此，將最后的輸出層類別由1000 改為3，輸入層圖像統(tǒng)一調整為224*224*3 大小格式，且由于本實驗的訓練樣本較少，本文主要采用遷移學習的方式，遷移學習就是利用已有的深度神經網絡（VGG16，ResNet，GoogLeNet 等）進行簡單的微調。保留VGG 網絡前面原始權重不變，只訓練全連接層。由于GoogLeNet 與ResNet50 網絡輸入及分類類別數與VGG16 都相同，因此，基于上述操作，分別采用VGG16，GoogLeNet，ResNet50 網絡對數據進行訓練。

2.2.2 基于CNN網絡結構的白酒微觀圖像預處理

LeNet-5 網絡結構中白酒微觀圖像預處理，如圖13 所示，將圖片大小由4096*4224 集體歸一化至32*32 尺寸；ResNet50、VGG16、GoogLeNet 等網絡結構，將圖片大小由4096*4224 集體歸一化至224*224尺寸。

2.2.3 實驗結果與分析

（1）采用LeNet-5 網絡結構時，訓練各參數中batch 大小為128，學習率為0.001，迭代次數為100。具體訓練過程中訓練樣本正確率變化如圖14所示，圖中橫坐標代表訓練的迭代次數，縱坐標為訓練正確率。由圖14可知，本文針對白酒微觀圖像分類識別所構建的卷積神經網絡在訓練白酒微觀圖像過程中達到了較好的效果，該網絡結構在訓練迭代到第30 次左右時開始接近收斂，在迭代到50 次時，樣本訓練準確率趨于穩(wěn)定接近88.89%。

（2）采用VGG16 網絡結構時，訓練各參數中batch 大小為128，學習率為0.001，迭代次數為50，訓練結果如圖15所示，其訓練準確率達到88%。

圖15 VGG16網絡訓練結果圖

（3）采用GoogLeNet 網絡結構時，訓練各參數中batch 大小為128，學習率為0.001，迭代次數為50，訓練結果如圖16 所示，其訓練準確率達到94%。

圖16 GoogLeNet網絡訓練結果圖

（4）采用ResNet50 網絡結構時，訓練各參數中batch 大小為128，學習率為0.001，迭代次數為50，訓練結果如圖17所示，其訓練準確率達到96%。

3 結論

圖17 ResNet50網絡訓練結果圖

本研究通過將冷凍電鏡技術與深度學習技術相結合，應用卷積神經網絡對白酒樣品的冷凍電鏡成像照片信息進行鑒別分類，主要采用了LeNet-5、ResNet50、VGG16、GoogLeNet 等網絡結構，針對白酒微觀圖像分類識別所構建的卷積神經網絡在訓練白酒微觀圖像過程中達到了較好的效果，相對而言，ResNet50 網絡結構的訓練效果最佳，結果顯示，采用ResNet50 網絡結構時，樣本訓練準確率達到96%。本研究首次將冷凍電鏡技術應用于白酒微觀形態(tài)的觀測，客觀來看，該研究存在一些不足，因冷凍電鏡的實驗成本較高，本文選取的樣本量相對較少，準確率的提升依賴于大數據量，因此，在下一步研究中，將進一步加大數據的收集，應該可以通過訓練進一步提升準確率。未來，可以預見，冷凍電鏡技術與深度學習技術的結合，除在白酒微觀觀測方面具有很高的應用價值外，在液體樣品（食品等）觀測方面也將會有相當廣闊的應用前景。