施 思，張 霞，楊康卓，廖勤儉，喬宗偉，2，鄭 佳，劉多濤

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644007）

白酒釀造是一項生物工程，特定白酒產(chǎn)區(qū)會在長期的馴化過程中孕育出一個較為穩(wěn)定的“微生物圈”，而這個“微生物圈”與白酒釀造的整個過程密切相關。因此，白酒微生物的研究歷來都是重要的討論課題。在這個圈子里，細菌、酵母和霉菌是優(yōu)勢菌，大量的研究也主要集中于這些菌群在各個釀造區(qū)系中的分離鑒定、功能性物質(zhì)分析和相關應用等方面[1-4]。在傳統(tǒng)白酒釀造微生態(tài)的研究中，放線菌數(shù)量較少，對于這類菌群的研究并不充分，目前少量的生物調(diào)節(jié)機理闡釋也主要集中在醬香和清香型白酒釀造環(huán)境中[5-6]。眾所周知，放線菌具有產(chǎn)生大量次級代謝產(chǎn)物的能力，極強的生物調(diào)控作用，在生物醫(yī)藥領域中放線菌的研究已相對成熟。鑒于放線菌強大的生物調(diào)控能力，很有必要繼續(xù)發(fā)掘其在獨特的釀造環(huán)境中對發(fā)酵過程的生物調(diào)節(jié)作用及價值。

本研究立足五糧液特有的釀造資源，將已獲得的放線菌株在實驗室條件下充分發(fā)酵，以獲得大量的代謝產(chǎn)物。通過純菌株復配液態(tài)發(fā)酵試驗探索放線菌在代謝調(diào)控方面的潛力；從新的角度來進一步揭示濃香型白酒的發(fā)酵機理，為白酒品質(zhì)提升提供更多的基礎理論和技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株來源

實驗室保存菌株：鏈霉菌Streptomyces sp.JP12（分離于窖皮泥，氣生菌絲為長鏈彎曲）、鏈霉菌Streptomyces sp.RZ1（分離于糟醅，氣生菌絲為初級松環(huán)）、小單胞菌Micromonospora sp.JD3（分離于窖底泥）；釀酒酵母S.cerevisiaeJ7 和芽孢桿菌Bacillus sp.X6均分離于糟醅。

1.1.2 試劑

菌株復配液態(tài)共酵培養(yǎng)基成分為（參考糧食中碳氮質(zhì)量比約為6.5∶1）[7]：葡萄糖17.5 g/L，細菌學蛋白胨2.7 g/L，氯化鈉0.5 g/L。培養(yǎng)基相關試劑均為國產(chǎn)分析純，色譜分析相關試劑均為進口色譜純。

1.1.3 設備與儀器

離心機（5810），德國Eppendorf 公司；pH 計（inoLabpH740），德國WTW；生化培養(yǎng)箱（LRH）、恒溫振蕩器（THZ-98C），上海一恒科技；頂空固相微萃?。–AR/DVB/PDMS 纖維萃取，50 μm），美國Supelco 公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，7890B-5977B），高效液相色譜儀（1100），美國Agilent公司；色譜柱（Venusil ASB C184.6 mm×250 mm，5 μm），天津博納艾杰爾公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌發(fā)酵物的提取

將放線菌培養(yǎng)物置于28 ℃搖床，120 r/min，培養(yǎng)5 d 獲取發(fā)酵液；發(fā)酵液12000 r/min 離心15 min取上清液；上清液經(jīng)0.2 μm 微孔濾膜過濾，收集得到本試驗所用發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.2 發(fā)酵力測定

發(fā)酵力：1 mL 酵母菌液發(fā)酵72 h 利用蔗糖產(chǎn)生二氧化碳的毫升數(shù)，即mL/(mL·72 h)，底物為8 %的蔗糖溶液。本試驗采用的發(fā)酵溫度為28 ℃和33 ℃，試驗組添加1 mL 酵母菌液和1 mL 放線菌發(fā)酵產(chǎn)物，以不添加放線菌發(fā)酵產(chǎn)物的純酵母發(fā)酵液為對照組，其他溶液配制參數(shù)不變[8]。

1.2.3 菌株復配液態(tài)共酵

1.2.3.1 芽孢桿菌與放線菌復配發(fā)酵

試驗組培養(yǎng)基中添加2 %的細菌X6 種子液和2 %的放線菌發(fā)酵產(chǎn)物，以不添加放線菌發(fā)酵產(chǎn)物的純細菌培養(yǎng)液為對照組，置于33 ℃靜止培養(yǎng)5 d。發(fā)酵結束后，測pH值，并用0.45 μm微孔濾膜過濾，收集5 mL過濾液供有機酸檢測備用。

1.2.3.2 釀酒酵母與放線菌復配發(fā)酵

試驗組培養(yǎng)基中添加2 %的酵母J7 種子液和2%的放線菌發(fā)酵產(chǎn)物，以不添加放線菌發(fā)酵產(chǎn)物的純酵母培養(yǎng)液為對照組。將其中一組用乳酸調(diào)節(jié)pH5.5，置于28 ℃靜止培養(yǎng)5 d；另一組用乳酸調(diào)節(jié)pH4.5，置于33 ℃靜止培養(yǎng)5 d。發(fā)酵結束后，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，收集1 mL 過濾液供揮發(fā)性香氣物質(zhì)檢測備用。

1.2.4 色譜分析

有機酸含量檢測采用HPLC法測定[9]，標準曲線為：y=0.284x-3.0446，R2=0.9999。揮發(fā)性香氣物質(zhì)檢測采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測定[10]。

1.2.5 代謝物路徑分析

為進一步闡釋放線菌調(diào)控產(chǎn)生的代謝物差異的生物學意義，使用MetaboAnalyst4.0 中路徑分析模塊，將相應的代謝物分別富集到釀酒酵母和芽孢桿菌的代謝途徑上，使用超幾何分布法計算，解析其調(diào)控路徑。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵力檢測

酵母與不同放線菌發(fā)酵產(chǎn)物在28 ℃和33 ℃共酵時發(fā)酵力的變化情況結果如圖1所示。

由圖1 可知，與對照組相比，3 組放線菌發(fā)酵產(chǎn)物具有程度不同地促進發(fā)酵作用。在不同溫度下，鏈霉菌JP12 發(fā)酵產(chǎn)物均能極大提升釀酒酵母J7 的發(fā)酵水平。

圖1 不同組別發(fā)酵力檢測結果

2.2 發(fā)酵液pH值變化及有機酸檢測

將實驗室保存的1 株產(chǎn)酸的芽孢桿菌X6 與放線菌產(chǎn)物進行復配發(fā)酵，初始pH 6.95，33 ℃靜止培養(yǎng)5 d 后，各發(fā)酵組pH 值變化情況分別為：對照組5.4、JP12 組5.74、JD3 組5.29，RZ1 組5.86。初步判斷，JP12 和RZ1 組產(chǎn)物具有抑制產(chǎn)酸的趨勢。通過對發(fā)酵液中四大酸的分析表明，JP12 和RZ1 組產(chǎn)物對細菌的產(chǎn)酸調(diào)控主要是抑制了乳酸的代謝，與此同時激活了少量己酸的生成。發(fā)酵液中四大酸的分析結果見表1。

2.3 揮發(fā)性香氣物質(zhì)檢測

揮發(fā)性香味物質(zhì)對于白酒的感官評價具有重要影響，本試驗檢測了低溫低酸A 組（28 ℃、pH5.5）和高溫高酸B組（33 ℃、pH4.5）發(fā)酵情況下，揮發(fā)性物質(zhì)的代謝情況，如表2所示。

由表2 可知，3 株放線菌對各香味物質(zhì)生成的影響程度不一。如異丁醇在低溫低酸的發(fā)酵條件下，3 組試驗組與空白組相比，產(chǎn)量分別提高了238.9%、225%和249%；而在高溫高酸的發(fā)酵條件下，試驗組中的異丁醇與對照組相比產(chǎn)量偏低，影響不顯著。在己酸乙酯的生成影響中，JP12 和JD3試驗組在兩種發(fā)酵條件下都能促進己酸乙酯的生成，尤其是JP12 組在33℃、pH4.5 的試驗條件下，將己酸乙酯的含量提高了669.4%。苯乙醇一般認為是具有玫瑰香的一類風味物質(zhì)[11-12]，試驗結果顯示，3 株放線菌產(chǎn)物復配試驗組中，苯乙醇的含量在兩種發(fā)酵條件下都顯著升高。從苯乙醛的檢測結果來看，初步推測是放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物促進了苯乙醛的還原反應生成了苯乙醇，同時通過酯化作用生成了乙酸苯乙酯。從綜合指標來看，菌株JP12 具有生產(chǎn)應用的潛能。

表1 發(fā)酵液中四大酸的分析結果 (mg/L)

2.4 代謝路徑分析

為了探索放線菌產(chǎn)物在復配發(fā)酵中潛在的代謝調(diào)控途徑，試驗使用MetaboAnalyst4.0 對相關的代謝途徑進行解析。上述試驗結果顯示，放線菌發(fā)酵產(chǎn)物具有降乳增己以及促進蔗糖代謝和生成苯乙醇的調(diào)控潛能，研究將乳酸、己酸、蔗糖、苯乙醛、苯乙醇分別富集到對應的芽孢桿菌及釀酒酵母的代謝途徑，得到途徑分析圖見圖2。

表2 揮發(fā)性香氣物質(zhì)檢測結果 (μg/L)

圖2 代謝途徑分析

圖2 芽孢桿菌代謝通路分析結果顯示共獲得6條途徑，基于影響值大于0.01 對關鍵代謝途徑進行篩選[13]，結果發(fā)現(xiàn)有3 條關鍵代謝途徑分別是丙酮酸代謝、硫代謝和糖酵解途徑。在模塊中點擊途徑圖中的相應圓圈，可以得到途徑解析：在糖酵解途徑中葡萄糖在葡萄糖激酶的作用下生成6-磷酸葡萄糖，再經(jīng)果糖-6-磷酸激酶-1、醛縮酶、磷酸丙酮異構酶、丙酮酸激酶等酶作用下生成丙酮酸；在硫代謝中，硫酸鹽等物質(zhì)通過生成甲磺酸、L-同型半胱氨酸、O-乙?；?L-絲氨酸、L-高蘇氨酸等物質(zhì)，并最終代謝生成烷磺鹽酸、亞硫酸鹽、半胱氨酸、乙酸鹽和琥珀酸酯；在芽孢桿菌的丙酮酸代謝途徑中，并無乙醇的生成，主要涉及乙醛代謝，生成乳酸、乙酸鹽、丙酮酸、草酰乙酸及乙酰輔酶A 等代謝產(chǎn)物。這3 條代謝途徑中影響值較高的物質(zhì)為乙酸鹽和乳酸。

圖2 釀酒酵母代謝途徑分析結果顯示共獲得3條途徑，這3 條關鍵代謝途徑分別是苯丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝及半乳糖代謝，其影響值依次為0.4、0.05669 和0.02564。在苯丙氨酸代謝途徑中，苯乙醛影響值最高，由苯丙酮酸代謝生成；在半乳糖代謝中，蔗糖分別生成D-葡萄糖和D-果糖；在淀粉和蔗糖代謝中，淀粉與蔗糖的最終代謝物為D-葡萄糖。

3 討論

放線菌是產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物最多的微生物，且大多具有生物調(diào)控作用。在實驗過程中，相關放線菌產(chǎn)物并未對酵母和芽孢桿菌的生長繁殖產(chǎn)生破壞，只是對相關的代謝途徑進行了不同的調(diào)控，如促進酵母蔗糖代謝、“控乳增己”和增強己酸乙酯、苯乙醇等風味物質(zhì)。通過對放線菌生物調(diào)控的研究，可以將其中合理的調(diào)控應用到生產(chǎn)工藝的改善，同時通過對其代謝途徑的解析，可以得到一些關鍵的中間代謝物，以便為進一步完善發(fā)酵機理提供更多的研究選擇。研究也將在下一步對相關放線菌的代謝產(chǎn)物進行分離鑒定，為精準調(diào)控提供更多的可能。