陸方，郭然，林江，楊爍慧，傅彩霞，劉孟瀟，俞健力

作者單位：1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院放射科，上海201203；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院放射科，上海200031；3.上海市影像醫(yī)學(xué)研究所，上海200031；4.上海市中醫(yī)醫(yī)院放射科，上海200071；5.西門子(深圳)磁共振有限公司應(yīng)用開發(fā)部，深圳518057；6.西門子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司科研市場部，上海201318

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為我國第四位常見惡性腫瘤及第三位致死腫瘤。世界報(bào)道的HCC 病例中，我國占約55%，因HCC 而死亡患者中，有45%～50%亦發(fā)生在我國，因而嚴(yán)重威脅著我國人民的生命和健康[1,2]。肝細(xì)胞癌是富血供腫瘤，具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)腫瘤血管生成能力，血管越豐富，患者預(yù)后越差[3]。因此，腫瘤新生血管已成為抗HCC 藥物作用的靶點(diǎn)之一，對(duì)于巴塞羅那肝細(xì)胞癌分期晚期或復(fù)發(fā)的HCC 患者，抗血管生成為重要治療手段[4]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的一種產(chǎn)品化的中藥——華蟾素能夠用于抗中晚期惡性腫瘤血管生成的治療[5-6]。腫瘤血管生成一直是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，且與預(yù)后密切相關(guān)，目前評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)血管生成公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”是病理學(xué)上通過穿刺或手術(shù)獲得組織標(biāo)本并通過血管免疫組化染色及定量測量得到的腫瘤微血管密度(micro-vessel density，MVD)，但該法屬于有創(chuàng)檢查，而且容易受取材部位、操作者水平等的影響出現(xiàn)偏移。隨著磁共振磁敏感加權(quán)成像(susceptibilityweighted imaging，SWI)和特殊對(duì)比劑超微超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤內(nèi)血管亦能被定量或者半定量評(píng)估[7-8]，使得無創(chuàng)且客觀地評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)血管量成為可能。因此本研究的目的是通過USPIO增強(qiáng)三維磁敏感加權(quán)成像(three dimensional-susceptibility-weighted imaging，3D-SWI)來活體評(píng)價(jià)華蟾素抗裸鼠原位HCC腫瘤內(nèi)大血管生成的有效性。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型制作

本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)日期：2017年4月10日)。

建立裸鼠原位HCC-LM3模型：首先無菌條件下將HCC-LM3 細(xì)胞(5×106/0.2 mL/site)注入周齡為4～6 周且體質(zhì)量為23～25 g 的1 只雄性BALB/C 裸小鼠(購自中國科學(xué)院上海藥物研究所)左中外側(cè)腋下皮膚下后飼養(yǎng)。當(dāng)腫瘤生長到長徑超過1 cm，將腫瘤取下并切成1 mm3大小的瘤塊若干分別接種入16 只雄性BALB/C 裸小鼠肝左葉包膜下后飼養(yǎng)21 天。隨后，荷瘤裸小鼠被隨機(jī)分成2 組，分別為華蟾素治療組和生理鹽水對(duì)照組，每組8只。其中華蟾素治療組荷瘤裸鼠每天腹腔注射華蟾素注射液(安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格5 mL×10 支/盒) 0.2 mL，生理鹽水對(duì)照組荷瘤裸鼠每天腹腔注射0.9%的生理鹽水0.2 mL，共干預(yù)20天。

1.2 磁共振掃描

干預(yù)后的第21 天，所有荷瘤裸鼠用3%戊巴比妥鈉按40 mg/kg 的劑量經(jīng)腹腔麻醉后，俯臥位固定于專用動(dòng)物架上，行3.0 T MRI (MAGNETOM Skyra；西門子醫(yī)療，埃朗根，德國)掃描，使用8 通道小動(dòng)物線圈(晨光，上海，中國)。先行常規(guī)磁共振掃描，序列和參數(shù)如下：橫斷位T2WI 快速自旋回波序列(重復(fù)時(shí)間/回波時(shí)間4000/65 ms；視野100 mm；翻轉(zhuǎn)角150°)，冠狀位T2WI 快速自旋回波序列(重復(fù)時(shí)間/回波時(shí)間4000/70 ms；視野100 mm；翻轉(zhuǎn)角150°)和橫斷位T1WI 快速自旋回波序列(重復(fù)時(shí)間/回波時(shí)間480/11 ms；視野100 mm；翻轉(zhuǎn)角131°)，掃描時(shí)間分別為1 min 56 s、2 min 28 s和2 min 4 s。

3D USPIO 增強(qiáng)橫斷位SWI 序列參數(shù)為：重復(fù)時(shí)間/回波時(shí)間205/10 ms；矩陣200×320；層厚1 mm；層間距0.2 mm；體素0.2×0.2×1 mm3；視野120 mm；翻轉(zhuǎn)角20°；帶寬380 Hz/Px；掃描時(shí)間，5 min 25 s。使用自動(dòng)校準(zhǔn)部分并行采集技術(shù)，加速因子2。所有荷瘤裸鼠用8 mg/kg 劑量的USPIO (鐵晶粒尺寸為6.1 nm，水合粒徑最大至20 nm，上海交通大學(xué)生物工程學(xué)院Med-X 研究所提供)用4.5 號(hào)靜脈輸液針經(jīng)荷瘤裸鼠尾靜脈以0.1 mL/s的速率團(tuán)注。注射完畢后經(jīng)過5 min，等待USPIO 在血液中穩(wěn)態(tài)分布后，行SWI掃描。原始圖像掃描結(jié)束后在線獲得SWI 后處理圖像，包括幅度圖、相位圖、最小密度投影圖和SWI圖。

1.3 磁敏感加權(quán)圖像評(píng)價(jià)

所有評(píng)價(jià)均在后處理獲得的SWI圖像上進(jìn)行[7-8]。荷瘤裸鼠的圖像分別由具有14年和18年肝臟MRI診斷經(jīng)驗(yàn)的放射科副主任醫(yī)師在西門子后處理工作站上進(jìn)行評(píng)價(jià)。該2 名副主任醫(yī)師均不知具體荷瘤裸鼠分組和病理情況。他們先瀏覽常規(guī)MRI圖像，包括T1WI、T2WI，目的是觀察有無明顯的腫瘤內(nèi)出血。然后，該2 名副主任醫(yī)師在USPIO 增強(qiáng)SWI 上對(duì)腫瘤內(nèi)磁敏感信號(hào)(intratumoral susceptibility signal，ITSS)計(jì)數(shù)后進(jìn)行評(píng)分，一個(gè)月后經(jīng)驗(yàn)為18 年的副主任醫(yī)師進(jìn)行ITSS 的第二次評(píng)價(jià)。ITSS 被定義為SWI圖像中腫瘤連續(xù)層面上均可追蹤到的上下延續(xù)的低信號(hào)沙礫或點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，或一個(gè)層面上呈前后、左右分布的線樣或弧形結(jié)構(gòu)、沙礫或點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)以及點(diǎn)狀與線樣或與弧形相混合[8]。這些結(jié)構(gòu)在常規(guī)MRI序列上不可確切顯示。SWI 上腫瘤內(nèi)較大顆粒狀低信號(hào)，同時(shí)T2WI 低信號(hào)，和/或T1WI 上高信號(hào)，并且不能前后層面追蹤，可能是出血成分，在計(jì)數(shù)和評(píng)分時(shí)需不計(jì)入在ITSS內(nèi)。不連續(xù)模糊或淡片狀的低信號(hào)結(jié)構(gòu)也需排除。在腫瘤中心層面進(jìn)行ITSS 評(píng)分，采用0～5 分法：0 分，無ITSS；1 分，1～5 個(gè)；2 分，6～10 個(gè)；3 分，11～15 個(gè)；4 分，16～20 個(gè)；5 分，等于或大于21個(gè)ITSS。

1.4 腫瘤體積測量

腫瘤體積在USPIO 增強(qiáng)SWI 序列上進(jìn)行。荷瘤裸鼠腫瘤于該序列上以相對(duì)高信號(hào)為主，肝臟則為低信號(hào)，因此兩者能夠清楚地區(qū)分開來。由一名具有10 年MRI 使用經(jīng)驗(yàn)的主管技師將該序列導(dǎo)入西門子syngo.via VB10 軟件，在腫瘤的每一個(gè)層面沿著腫瘤邊緣用手繪模式描繪出腫瘤邊界，然后自動(dòng)計(jì)算獲得腫瘤體積。

1.5 組織學(xué)檢查

荷瘤裸鼠MRI 掃描結(jié)束后，立即處死，剝離腫瘤連同肝臟組織放入10%的緩沖甲醛溶液中，固定24 h以上。依據(jù)SWI 層厚，切取腫瘤中央約1 mm 的組織包埋在石蠟中再切成3 μm 厚度的薄片用于組織學(xué)檢查。行蘇木精伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色觀察腫瘤組織及細(xì)胞一般形態(tài)及結(jié)構(gòu)情況。行免疫組織化學(xué)抗CD31 染色(一抗，Abcam，劍橋，英國)觀察腫瘤內(nèi)血管情況。腫瘤MVD 獲取方法：所有抗CD31 染色切片使用Aperio ScanScope 和Leica SCN400 (Leica 生物系統(tǒng)；伊利諾伊州，美國)全景掃描后存儲(chǔ)為大約500～700 MB 大小的Aperio scn 文件，接著傳輸?shù)诫娔X，使用SlidePath Gateway Client 軟件(Leica 生物系統(tǒng))在3840×2160 像素的屏幕分辨率下進(jìn)行血管計(jì)數(shù)[9]。具體步驟：由一名具有5 年從事肝癌研究經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師在不知荷瘤裸鼠具體分組和影像學(xué)結(jié)果的情況下，首先在全景圖低倍放大(4×和10×)的條件下瀏覽切片，分別找到5 個(gè)抗CD31 染色陽性血管最密集區(qū)域(熱點(diǎn))；然后將每個(gè)熱點(diǎn)相應(yīng)的區(qū)域放大到最高倍(40×)條件下，選取血管數(shù)量最多區(qū)域分別進(jìn)行人工血管計(jì)數(shù)，取均值，獲得該腫瘤的MVD。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)前期研究ITSS 治療前后的數(shù)值[7]，在遵循“3R”——替代(replacement)、減少(reduction)、優(yōu)化(refinement)的原則下，按照https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/research/sample-sizecalculations-iacuc估算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0 (IBM，紐約，美國)軟件完成。計(jì)量數(shù)據(jù)用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示；等級(jí)資料用中位數(shù)(P25，P75)表示。Mann-WhitneyU檢驗(yàn)用于評(píng)估兩組USPIO增強(qiáng)SWI圖像上ITSS評(píng)分、腫瘤體積以及病理切片的腫瘤MVD。Spearman 等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)用于分析ITSS 評(píng)分與MVD 和腫瘤體積的相關(guān)性。相關(guān)程度通過相關(guān)系數(shù)(r)來判斷：0≤|r|＜0.2 不相關(guān)；0.2≤|r|≤0.4低度相關(guān)；0.4＜|r|≤0.6中度相關(guān)；0.6＜|r|≤0.8 高度相關(guān)和|r|＞0.8 極度相關(guān)。通過計(jì)算Kappa 值獲得觀察者間和觀察者內(nèi)ITSS 評(píng)分一致性評(píng)價(jià)。所有P均為雙尾，P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

入組裸鼠原位HCC-LM3 模型樣本量估算：α 取0.05、β 取0.2，即以80%的概率達(dá)到P＜0.05 的統(tǒng)計(jì)顯著性所需的動(dòng)物數(shù)量為16 只，即華蟾素治療組和生理鹽水對(duì)照組各8 只。

荷瘤裸鼠干預(yù)過程中，華蟾素治療組死亡3 只(3/8，37.5%)，生理鹽水對(duì)照組死亡1 只(1/8，12.5%)。華蟾素治療組荷瘤裸鼠死亡原因分別為肝彌漫性出血和腫瘤腹腔彌漫性轉(zhuǎn)移。生理鹽水對(duì)照組荷瘤裸鼠死亡原因?yàn)槟[瘤腹腔彌漫性轉(zhuǎn)移，在后續(xù)存活荷瘤裸鼠取瘤過程中發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組1 只亦出現(xiàn)腫瘤腹腔彌漫性轉(zhuǎn)移。其余荷瘤裸鼠均未發(fā)現(xiàn)腫瘤腹腔彌漫性轉(zhuǎn)移和肝臟彌漫性出血。

肝臟成像序列在12 只存活荷瘤裸鼠中順利完成，獲得圖像沒有明顯的偽影(華蟾素治療組5 只，生理鹽水對(duì)照組7 只)。所有荷瘤裸鼠HCC 腫瘤呈類圓形或類橢圓形，在TIWI 上呈稍低信號(hào)，T2WI 上呈稍高信號(hào)，SWI 由于肝實(shí)質(zhì)吸收USPIO 后信號(hào)下降呈低信號(hào)，腫瘤表現(xiàn)為相對(duì)高信號(hào)。腫瘤內(nèi)出血表現(xiàn)為點(diǎn)、片狀T1WI 高，T2WI、SWI 低信號(hào)影。生理鹽水對(duì)照組中1 只荷瘤裸鼠、華蟾素治療組中2 只荷瘤裸鼠肉眼可見腫瘤內(nèi)出血灶，于評(píng)估ITSS 時(shí)這些出血灶未計(jì)入在內(nèi)。

華蟾素治療組腫瘤ITSS 評(píng)分顯著低于生理鹽水對(duì)照組(表1，圖1)。華蟾素治療組腫瘤體積與生理鹽水對(duì)照組相比未見明顯差異(表1)。華蟾素治療組腫瘤MVD顯著低于生理鹽水對(duì)照組(表1，圖2)。

圖1 HCC USPⅠO增強(qiáng)SWⅠ顯示生理鹽水對(duì)照組(A)和華蟾素治療組(B)裸鼠原位肝細(xì)胞癌腫瘤內(nèi)ⅠTSS(白箭)評(píng)分分別為5和4，華蟾素治療組(B)腫瘤ⅠTSS明顯少于生理鹽水對(duì)照組(A) 圖2 CD31免疫組化染色顯示生理鹽水對(duì)照組(A)和華蟾素治療組(B)裸鼠原位肝細(xì)胞癌腫瘤內(nèi)微血管(棕色)，華蟾素治療組(B)腫瘤微血管數(shù)明顯少于生理鹽水對(duì)照組(A)，圖像放大40倍Fig. 1 Ⅰntratumoral susceptibility signal intensity (ⅠTSS) (white arrows) in the cinobufacini treated and saline control tumors on USPⅠO-enhanced SWⅠ. Ⅰn the treated tumors,ⅠTSS is scored as grade 4(B),and in the saline control tumors,ⅠTSS is scored as grade 5(A).Fewer ⅠTSSs are noted in the treated tumors(B)than the saline control group (A). Fig. 2 Anti-CD31 immunohistochemistry staining shows brown tumor vessels of saline control group (A) and cinobufacini treated group(B)(magnification×40).Fewer tumor vessels are noted in the treated group(B)than the saline control group(A).

表1 生理鹽水對(duì)照組與華蟾素治療組主要指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of main indexes between cinobufacini treated group and saline control group

2 組12 只荷瘤裸鼠ITSS 評(píng)分與腫瘤MVD 高度正相關(guān)(r=0.647，P=0.022)；與腫瘤體積高度正相關(guān)(r=0.645，P=0.023)。2 組12 只荷瘤裸鼠腫瘤的ITSS 評(píng)分觀察者間和觀察者內(nèi)Kappa 值分別為0.745 (P=0.0002)和0.750 (P=0.0001)。

3 討論

通過活體USPIO 增強(qiáng)SWI MRI 成像，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)裸鼠原位HCC-LM3 模型經(jīng)華蟾素治療后ITSS 顯著減少，并且所有荷瘤裸鼠HCC-LM3 的ITSS 評(píng)分與病理MVD正相關(guān)。與生理鹽水對(duì)照組相比，華蟾素治療組腫瘤體積在未見明顯縮小的情況下，ITSS和MVD均減少，因此本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)華蟾素能夠早期抑制HCC腫瘤內(nèi)大血管生成。

3.1 USPIO 增強(qiáng)SWI MRI 成像評(píng)估HCC 腫瘤內(nèi)血管的可行性

腫瘤細(xì)胞的增殖離不開腫瘤血管的生成。經(jīng)過一段時(shí)間，腫瘤內(nèi)“早期”血管生成和“晚期”血管形成共存，分別對(duì)應(yīng)“微血管”與“大血管”[10-11]，兩者在腫瘤功能血管網(wǎng)中均必不可缺。評(píng)估抗腫瘤血管生成是否有效，不但是微血管，監(jiān)測腫瘤內(nèi)大血管也至關(guān)重要。然而，與正常組織的血管不同，腫瘤血管在形態(tài)學(xué)上和生物學(xué)上均不成熟，因而血管通透性較正常血管也高[12]。大分子對(duì)比劑USPIO 顆粒體積較大，不容易從血管壁擴(kuò)散至細(xì)胞外間隙，我們的前期研究顯示USPIO 增強(qiáng)SWI MRI 中的ITSS 能較好地反映裸鼠原位HCC 腫瘤內(nèi)大血管的情況[8]，并能夠活體無創(chuàng)監(jiān)測HCC 大血管經(jīng)靶向藥物抗血管生成的療效[7]。因此，代表腫瘤內(nèi)大血管的ITSS是一種有效反映腫瘤內(nèi)血管的影像學(xué)指標(biāo)。目前，SWI ITSS 半定量評(píng)估已成功用于膠質(zhì)瘤分級(jí)，Bhattacharjee 等[13]經(jīng)過改良使用定量法ITSS血管容積(ITSS vasculature volume，IVV)排除了腫瘤內(nèi)出血的影響，進(jìn)一步提高了膠質(zhì)瘤的分級(jí)的敏感度及特異度。Deguchi 等[14]研究發(fā)現(xiàn)ITSS還可用于預(yù)測中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性淋巴瘤治療前對(duì)化療的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究中使用順磁性大分子對(duì)比劑USPIO 進(jìn)行SWI MRI 增強(qiáng)，較常規(guī)SWI更容易識(shí)別腫瘤內(nèi)ITSS，進(jìn)一步提高半定量評(píng)估的準(zhǔn)確度。通過本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)USPIO 增強(qiáng)SWI MRI新技術(shù)可以作為一種有效評(píng)價(jià)華蟾素抗腫瘤內(nèi)大血管的新方法，值得進(jìn)一步開發(fā)和研究。

3.2 華蟾素抑制肝癌血管的生成。

目前，治療HCC靶向抗血管生成的藥物主要為侖伐替尼或索拉非尼。然而有研究指出這些藥物的運(yùn)用并沒有明顯改善一部分患者的預(yù)后情況，還產(chǎn)生了耐藥性[15,16]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中重要組成部分——中藥，被用于抗惡性腫瘤血管生成的治療歷史悠久[17]。例如白花蛇舌草、蝎毒多肽、羥基紅花黃色素A、β-欖香烯和華蟾素等多種藥物被用于抗HCC 血管生成[18]。其中，華蟾素是一種成藥，有研究顯示華蟾素聯(lián)合三氧化二砷能夠抗裸鼠人肝癌移植瘤的血管新生，降低腫瘤的MVD[19]。也有研究指出華蟾素的主要成分——蟾毒靈，能夠通過介導(dǎo)經(jīng)典血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路來加強(qiáng)索拉非尼抗HCC 血管生成作用[18]。本實(shí)驗(yàn)研究亦觀察到與生理鹽水對(duì)照組相比，華蟾素治療組腫瘤體積在未見明顯縮小的情況下，ITSS 和MVD 均減少，證實(shí)了華蟾素能夠早期抑制HCC腫瘤血管生成。

3.3 華蟾素協(xié)同多激酶抑制劑治療肝癌的潛能

華蟾素與靶向藥多激酶抑制劑在抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤血管生成等方面具有協(xié)同作用。Wang 等[18,21]研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素主要活性成分蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼通過靶向調(diào)節(jié)mTOR/VEGF信號(hào)通路，協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞VEGF分泌進(jìn)而抑制腫瘤血管生成；通過促進(jìn)索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌凋亡相關(guān)蛋白Bax，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8 的活化，蟾毒靈亦協(xié)同索拉非尼抑制肝癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。華蟾素在上述方面表現(xiàn)出來的潛能值得我們今后利用USPIO 增強(qiáng)SWI MRI 等新技術(shù)對(duì)其聯(lián)合靶向藥物抗HCC 血管形成的協(xié)同機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入的活體可視化研究。

3.4 限制性及不足

本實(shí)驗(yàn)研究中，我們發(fā)現(xiàn)華蟾素治療組荷瘤裸鼠的死亡率為37.5%，高于生理鹽水對(duì)照組，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)死亡的主要原因是肝臟的彌漫性出血，生理鹽水對(duì)照組中，雖有一只荷瘤裸鼠有彌漫性腹腔腫瘤轉(zhuǎn)移，但未見肝實(shí)質(zhì)彌漫性出血。經(jīng)分析華蟾素注射液具有活血化瘀的作用，它的副作用之一就是血小板減少，使用后出血的風(fēng)險(xiǎn)增加[20]。該結(jié)果提示在今后華蟾素抗惡性腫瘤的治療過程中可能需要監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室凝血指標(biāo)，并適當(dāng)?shù)卦黾由“宓乃幬?。也提示在未來使用華蟾素干預(yù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中需要擴(kuò)大樣本量或設(shè)計(jì)相應(yīng)預(yù)案來保證實(shí)驗(yàn)的可行性。

本實(shí)驗(yàn)研究具有幾方面局限性。首先，裸鼠HCC腫瘤組織切片與SWI的掃描層面可能不完全匹配；由于腫瘤血管異質(zhì)性，此切面獲得MVD也不能完全代表觀察腫瘤層面的大血管情況。第二，由于病理組織學(xué)技術(shù)上的困難，我們目前無法將ITSS 在病理上與HCC大血管進(jìn)行直接比對(duì)。此外，免疫組化CD31染色切片上通過在切片最高倍數(shù)放大的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工MVD 計(jì)數(shù)，也會(huì)產(chǎn)生偏移，今后會(huì)通過軟件測量來增加結(jié)果的可靠性。第三，USPIO 在SWI 上具有放大效應(yīng)[22]，所以對(duì)ITSS 評(píng)價(jià)只能進(jìn)行人工半定量分析，而不能直接反映腫瘤大血管的真實(shí)數(shù)目。第四，雖然荷瘤裸鼠腫瘤內(nèi)肉眼可見的出血灶在常規(guī)MRI 序列上已被排除，但腫瘤內(nèi)微出血和USPIO被巨噬細(xì)胞吞噬均有可能影響ITSS 評(píng)分的準(zhǔn)確性。第五，本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少，但因?yàn)槭莿?dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，又有腫瘤的病理學(xué)結(jié)果做對(duì)照，本著對(duì)動(dòng)物倫理的遵循和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有效利用，即“3R”原則，我們認(rèn)為通過12只裸鼠HCC-LM3模型樣本量得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具可靠性。第六，本研究未進(jìn)行治療前的基線測量，原因在于根據(jù)前期研究裸鼠原位HCC-LM3腫瘤的ITSS在21天的時(shí)候變化差異不大[7]。最后，即使細(xì)胞株相同，人體HCC 與動(dòng)物模型HCC 仍不完全一致，華蟾素的治療效果也可能會(huì)不同，以后需要進(jìn)一步的臨床研究。

綜上所述，通過USPIO 增強(qiáng)SWI MRI 成像研究，華蟾素能夠抑制裸鼠原位肝細(xì)胞癌腫瘤內(nèi)大血管的生成。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。