王 道，朱洪怡，楚 毅*

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 a. 婦產(chǎn)科；b. 消化內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410011）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由18到22個(gè)核苷酸組成的短RNA分子［1］，可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)并且促進(jìn)個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)和癌變［2-6］等過程。這些分子通過與相應(yīng)的mRNA相互作用從而形成沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），能夠結(jié)合到3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）的互補(bǔ)序列，引起表達(dá)失調(diào)進(jìn)而破壞信號(hào)傳導(dǎo)途徑增加人類患疾病的風(fēng)險(xiǎn)［7］。此外，許多研究報(bào)告表明miRNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，將可能成為生物標(biāo)記物的候選者［8］。

人類miR-146a-5p（hsa-miR-146a-5p）自2006年被David Baltimore實(shí)驗(yàn)室在小鼠中鑒定發(fā)現(xiàn)后，其功能被一些研究證實(shí)在多種類型的癌癥中起抑制基因的作用［9-10］。但是，還有研究表明miR-146a-5p在多種類型的癌癥中起癌基因作用［11-12］。目前研究人員仍然對(duì)miR-146a-5p引起腫瘤的分子機(jī)制非常感興趣，如Li等［13］對(duì)miR-146a-5p在各種惡性腫瘤中的預(yù)后價(jià)值進(jìn)行全面薈萃分析，提出miRNA可能是早期預(yù)測(cè)癌癥的突破口。

本研究中我們采用多種生物信息數(shù)據(jù)庫提取hsa-miR-146a-5p的靶基因數(shù)據(jù)交集，并對(duì)其進(jìn)行全面的基因本體（gene ontology，GO）注釋分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of genes and genome，KEGG）通路富集分析，為未來對(duì)miR-146a-5p的靶基因分類鑒定及其在疾病中扮演的角色提供新的研究線索。

1 材料與方法

1.1 hsa-miR-146a-5p的定位和序列保守性的預(yù)測(cè)分析

利用UCSC（http://genome.ucsc.ed）等在線數(shù)據(jù)庫查找hsa-miR-146a-5p的堿基序列、染色體定位、物種保守性等基本信息；miRbase（http://www.miR-base.org/）在線數(shù)據(jù)庫搜尋hsa-miR-146a-5p在染色體的分布位置；使用Clustal Omega軟件分析16個(gè)不同物種如智人（Homo sapiens）、黑猩猩（Pan troglodytes）、小家鼠（Mus musculus）、褐家鼠（Rattus norvegicus）、青鳉（Oryzias latipes）、家兔（Oryctolagus cuniculus）等的成熟序列的堿基信息并預(yù)測(cè)其保守性（表1）。

1.2 hsa-miR-146a-5p在人類不同組織中的表達(dá)分析

運(yùn)用miGator v3.0數(shù)據(jù)庫（http://mirgator.obic.re.kr/）檢索hsa-miR-146a-5p在人類不同組織器官中的表達(dá)量，并且進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。該數(shù)據(jù)庫的測(cè)序數(shù)據(jù)均來自已發(fā)布的腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等的多個(gè)人類miRNA數(shù)據(jù)集。

1.3 hsa-miR-146a-5p靶基因以及編碼蛋白質(zhì)間的相互作用分析

通過最新版PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索近年來發(fā)表文獻(xiàn)得出，hsa-miR-146a-5p在轉(zhuǎn)錄后水平上介導(dǎo)調(diào)控相應(yīng)的靶基因，涉及參與了一系列疾病的發(fā)展和預(yù)后療效的評(píng)價(jià)（表2）。采用 Targetscan7.1（http://www.targetscan.org /vert71/）、miRDB（http://www.mirdb.org/）、mirDIP（http://ophid.utoronto.ca /mirDIP /index confirm.jsp）和DIANA TOOLS（http://diana. Imis. athena-innovation.gr/Diana-Tools/index.php）4個(gè)在線靶基因預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)靶基因，并用Venny 2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny /index.html）繪制4個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)靶基因的韋恩圖，取交集作為下一步靶基因數(shù)據(jù)集。將此數(shù)據(jù)集導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫（http://www.string-db.org）進(jìn)行蛋白互作預(yù)測(cè)分析，然后結(jié)合Cytoscape-v3.6軟件構(gòu)建靶基因編碼的蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 hsa-miR-146a-5p靶基因的GO注釋分析和KEGG富集分析

運(yùn)用Omicshare平臺(tái)工具（http://www.omicshare.com/）對(duì)韋恩圖的交集靶基因進(jìn)行GO注釋分析?；诔瑤缀畏植加?jì)算原理，從基因功能的3個(gè)方面：細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP），得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的GO注釋顯著性分析（P＜0.05）。同時(shí)，利用KOBAS數(shù)據(jù)庫（http://kobas.cbi.pku.edu.cn）對(duì)交集靶基因進(jìn)行KEGG通路相關(guān)的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集分析（P＜0.05為顯著性閾值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 hsa-miR-146a-5p的定位和序列保守性分析

在線檢索miRBase、UCSC數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)hsa-miR-146a-5p基因序列號(hào)為MIMAT0000449，定位于人類基因組chr5q33.3染色體（圖1），其基因位點(diǎn)在chr5:160 485 373～160 485 393之間。通過miR-Base 在線數(shù)據(jù)庫檢索miR-146a-5p成熟序列，結(jié)果顯示，已知的22個(gè)不同物種中存在成熟序列。我們下載了智人、小家鼠、褐家鼠、青鳉、家兔等16個(gè)不同物種的成熟序列（圖2）。Clustal Omega軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，hsa-miR-146a-5p成熟序列“UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU”在16個(gè)物種之間具有高度的保守性（表1），提示hsa-miR-146a-5p可能具有潛在的生物學(xué)功能。

圖1 hsa-miR-146a-5p在人類基因組中所處的位置Fig. 1 The location of hsa-miR-146a-5p in the human genome

圖2 不同物種miR-146a-5p的成熟序列Fig. 2 Mature sequence of miR-146a-5p in different species

2.2 hsa-miR-146a-5p在人類各組織的表達(dá)分析

hsa-miR-146a-5p在人體部分組織器官的表達(dá)情況見圖3，其中在淋巴細(xì)胞表達(dá)豐富程度最高，但是在其他組織中的表達(dá)量很低。

2.3 hsa-miR-146a-5p的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

利用新版PubMed、EBSCO快速全面檢索相關(guān)文獻(xiàn)，納入結(jié)果的文獻(xiàn)表明hsa-miR-146a-5p調(diào)控相應(yīng)的靶基因參與了多種疾病以及多條信號(hào)通路（表2）。選用TargetScan、miRDB、mirDIP和DIANA TOOLS 4個(gè)在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的靶基因個(gè)數(shù)分別為283、488、828和853。最后通過在線軟件Venny2.1對(duì)上述4個(gè)數(shù)據(jù)集合繪制韋恩圖推導(dǎo)靶基因交集（圖4），以備后續(xù)數(shù)據(jù)分析，具體見表3。

表1 不同物種miR-146a-5p成熟序列Tab. 1 Mature sequence of miR-146a-5p in different species

表2 hsa-miR-146a-5p調(diào)控的靶基因參與人類疾病Tab. 2 hsa-miR-146a-5p target genes involved in human disease

圖3 hsa-miR-146a-5p 在各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況Fig. 3 Expression analysis of hsa-miR-146a-5p in organs

表3 hsa-miR-146a-5p調(diào)控的靶基因數(shù)據(jù)集Tab. 3 Target gene data sets regulated by hsa-miR-146a-5p

2.4 靶基因編碼蛋白質(zhì)間的相互作用預(yù)測(cè)

將4個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到的靶基因交集導(dǎo)入String 11.0，分析靶基因編碼蛋白質(zhì)間的相互作用。然后，將String11.0分析結(jié)果結(jié)合Cytoscape_v3.8.0軟件構(gòu)建PPI圖。PPI結(jié)果顯示，hsa-miR-146a-5p的靶基因編碼蛋白質(zhì)間形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)互作圖。紅色連線代表比綠色打分相對(duì)較高，說明蛋白相互作用更強(qiáng)；藍(lán)色圓圈代表靶基因編碼的蛋白節(jié)點(diǎn)（圖5）。

2.5 hsa-miR-146a-5p的GO注釋分析

將韋恩圖交集得到的73個(gè)靶基因格式整理后提交到Omicshare Tools平臺(tái)。GO注釋分析結(jié)果表明：hsa-miR-146a-5p靶基因主要富集于細(xì)胞，包括細(xì)胞器、細(xì)胞膜及附近區(qū)域等14個(gè)細(xì)胞組分；涉及到22個(gè)生物學(xué)過程，包括細(xì)胞合成及代謝、應(yīng)激反應(yīng)、信號(hào)通路、正或負(fù)調(diào)控發(fā)育等；顯著富集于染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄活性激活、結(jié)構(gòu)分子活性激活、催化活性激活、轉(zhuǎn)錄因子活性配體激活等9個(gè)分子功能（圖6）。

圖4 hsa-miR-146a-5p的預(yù)測(cè)靶基因個(gè)數(shù)Fig. 4 Predicted number of target genes of hsa-miR-146a-5p

圖5 hsa-miR-146a-5p 預(yù)測(cè)靶基因所編碼蛋白質(zhì)間的相互作用分析Fig. 5 Protein-protein interaction network of the target genes of hsa-miR-146a-5p

2.6 hsa-miR-146a-5p預(yù)測(cè)靶基因的KEGG通路分析

以人類全基因組為背景基因，利用KOBAS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析。Top 10 KEGG結(jié)果表明，hsa-miR-146a-5p 靶基因主要富集在Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路、視黃酸誘導(dǎo)基因I樣受體（retinoic acid-inducible gene I like receptors，RLRs）信號(hào)通路中，以及包括病毒性乙肝、丙肝、瘧疾等疾病的相關(guān)通路中（P＜0.05）（圖7）。

圖6 hsa-miR-146a-5p 靶基因的GO注釋分析Fig. 6 GO function analysis of hsa-miR-146a-5p target gene

圖7 hsa-miR-146a-5p靶基因的KEGG通路富集分析Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis of hsa-miR-146a-5p target gene

3 討論

近年來，hsa-miR-146a-5p在癌癥、炎癥中的差異表達(dá)已經(jīng)得到廣泛的研究［14-19］，它是一種多效調(diào)節(jié)因子，但在一系列癌癥、炎癥反應(yīng)中的作用尚未完全被人們了解［20-21］。目前，也缺乏對(duì)hsa-miR-146a-5p 潛在靶點(diǎn)和相關(guān)功能通路的全面分析。生物信息學(xué)能夠快速預(yù)測(cè)miRNA靶基因，同時(shí)將數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的靶基因取交集，具有更好的可靠性。在本研究中，我們不僅探討了hsa-miR-146a-5p的預(yù)期靶標(biāo)集，還對(duì)其相關(guān)的富集功能進(jìn)行了分析研究。

本研究分析發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p的成熟序列在16個(gè)不同物種之間高度保守，推測(cè)hsa-miR-146a-5p可能具有重要的生物學(xué)功能，在機(jī)體中進(jìn)行相關(guān)基本生理活動(dòng)。同時(shí)，韋恩圖交集得到總共73個(gè)hsa-miR-146a-5p的靶基因，靶基因富集于細(xì)胞，包括細(xì)胞器、細(xì)胞膜及附近區(qū)域等14個(gè)細(xì)胞組分中。hsa-miR-146a-5p的靶基因顯著富集在機(jī)體代謝、炎癥刺激的免疫系統(tǒng)反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)、發(fā)育過程以及正向或負(fù)向調(diào)控生物學(xué)等過程；同時(shí)，其也顯著富集在TLRs信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、RLPs信號(hào)通路等通路中。TLRs和RLPs是關(guān)鍵的先天免疫模式識(shí)別受體，一些研究發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p能通過TLRs通路途徑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。例如Xu等［22］發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞的miR-146a-5p能夠通過TLR7-MyD88介導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生；Feng等［23］運(yùn)用miRNA芯片證實(shí)miR-146a促使白細(xì)胞的遷移；Hou等［24］揭示miR-146a在病毒感染過程中被上調(diào)，通過靶向TRAF6和IRAK1/2抑制視黃酸誘導(dǎo)基因I（retinoic acidinducible gene I，RIG-I）依賴性抗病毒信號(hào)途徑；Zhu等［25］和Meng等［26］在口腔癌、胰腺癌等臨床研究中證實(shí)了miR-146a-5p/NF-κB軸的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。此外，miR-146a-5p對(duì)促進(jìn)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的復(fù)制有積極影響，具有誘導(dǎo)肝損傷和癌變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［27-28］。特別是Van Loon等［29］報(bào)道m(xù)iRNA-146a參與了針對(duì)瘧疾的先天免疫，推測(cè)它具有可能成為藥物靶標(biāo)的潛力。

然而，hsa-miR-146a在不同類型腫瘤中異常表達(dá)的功能機(jī)制仍然不清楚。盡管Forloni等［30］揭示了miR-146a在黑色素瘤中高度上調(diào)可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生 ；Zhang等［31］報(bào)道m(xù)iR-146a-5p在肝細(xì)胞癌中被下調(diào)并起抑癌的作用；而Huang等［32］在非小細(xì)胞肺癌研究中稱miR-146a-5p過表達(dá)能夠抑制癌血管生成和腫瘤的發(fā)生。另幾項(xiàng)研究還表明［33-34］，miR-146a能夠通過NF-κB信號(hào)途徑抑制腫瘤擴(kuò)散。但迄今為止，學(xué)者對(duì)hsa-miR-146a-5p的功能仍知曉甚少，因?yàn)槿祟愔写嬖诔^30%的基因受miRNA調(diào)控，其中miR-146a可以靶向數(shù)百個(gè)miRNA，并且能夠影響參與功能相互作用途徑的許多基因的表達(dá)，這種影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文綜合運(yùn)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，預(yù)測(cè)和分析hsa-miR-146a-5p的保守性、GO注釋分析以及KEGG通路富集分析等方面，從而進(jìn)一步探討hsa-miR-146a-5p在腫瘤發(fā)生、免疫應(yīng)答及炎癥等中的潛在分子機(jī)制，為治療慢性炎癥、瘧疾、惡性腫瘤等疾病開辟了新的前景，對(duì)臨床治療的新療法提供了理論基礎(chǔ)。