裴 斌，樊志敏

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是發(fā)生于下消化道的一種惡性腫瘤，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)報(bào)道，全球每年有超百萬人被診斷為結(jié)直腸癌，其中死亡人數(shù)更是超過50萬，其發(fā)病率在全球癌癥中僅次于肺癌和乳腺癌位于第三位，病死率排在第四位[1]，在國(guó)內(nèi)發(fā)病率和病死率則分列第三位和第五位[2-3]。CRC因腸鏡、腫瘤標(biāo)志物等篩查手段的普及在以美國(guó)為代表的發(fā)達(dá)國(guó)家中發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，而在我國(guó)隨著生活水平的提高，人們喜食高油鹽、高脂食物，加之運(yùn)動(dòng)不足等，目前發(fā)病率一直處于上升狀態(tài)[4]，且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，給社會(huì)發(fā)展及人民健康造成嚴(yán)重威脅。結(jié)直腸癌早期缺乏典型臨床表現(xiàn)和體征，診斷困難，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期。CRC患者的生存時(shí)間與腫瘤的分期息息相關(guān)：Ⅰ期患者根治術(shù)后治愈率常超過90%、Ⅱ期患者手術(shù)配合輔助治療其5年生存率亦能達(dá)到85%左右；而中、晚期患者的生存率往往下降迅速，Ⅳ期腸癌患者只有不到12%的五年生存率，且手術(shù)治療后仍有超過30%的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[5]。目前治療CRC的主要方法是手術(shù)結(jié)合放化療，但對(duì)于有轉(zhuǎn)移者預(yù)后仍較差。

目前CRC診斷方法主要有：早期癥狀觀察(如有排便性狀改變、便血、腹痛、腹瀉等常見癥狀建議進(jìn)一步的檢查)，大便隱血試驗(yàn)(一種檢查消化系統(tǒng)疾病的簡(jiǎn)便方法，陽性者建議做胃腸鏡、明確出血病因)，肛門指檢(可檢查肛管直腸下段有無腫物、出血、疼痛等)，結(jié)腸鏡檢查(是結(jié)直腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，在進(jìn)行檢查時(shí)，能同時(shí)進(jìn)行預(yù)防性切除及取活檢，但因結(jié)腸鏡檢查具有傾入性，患者耐受性差，并發(fā)穿孔、出血等風(fēng)險(xiǎn)，檢查費(fèi)用高，其在我國(guó)未得到大規(guī)模推廣應(yīng)用)。上述常規(guī)篩查方法因敏感性、特異性較低，檢查費(fèi)用高，患者配合度差等原因難以廣泛應(yīng)用于臨床[6]，而目前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19 -9 等蛋白組學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)，p53 、APC等基因檢測(cè)也存在自身靈敏度和特異性不高等局限性，因而臨床深入研究CRC，尋求特異性強(qiáng)、靈敏性高的早期診斷方法迫在眉睫，代謝組學(xué)的興起為其提供了新的方法手段。本文主要介紹了代謝組學(xué)的概況及其在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展。

1 代謝組學(xué)概況

作為系統(tǒng)生物學(xué)新的分支學(xué)科，代謝組學(xué)效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想，利用高通量技術(shù)手段動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)分析生物體受生理、病理刺激或基因修飾時(shí)發(fā)生的代謝產(chǎn)物的變化[6-7]，判斷某一時(shí)刻生物體所處的整體狀態(tài)。代謝組是指生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的動(dòng)態(tài)整體，是參與生物體新陳代謝、維持生物體正常生長(zhǎng)功能的分子化合物的集合，其研究目標(biāo)常是相對(duì)分子量≤1 000的小分子代謝物，這些小分子代謝物包括脂質(zhì)、氨基酸、糖類、脂肪酸等。

代謝組學(xué)研究流程一般由樣品收集預(yù)處理、數(shù)據(jù)采集-代謝物分析、數(shù)據(jù)分析、生命現(xiàn)象闡釋幾部分構(gòu)成，目前代謝組學(xué)研究使用的生物體樣本范圍廣泛，常包括組織、體液、排泄物、細(xì)胞等[8]。血液和尿液等生物體液常被應(yīng)用于惡性腫瘤方面研究，但亦有相關(guān)學(xué)者認(rèn)為腫瘤組織比血液和尿液等體液穩(wěn)定，能更好地體現(xiàn)腫瘤本身的代謝特點(diǎn)，主要技術(shù)手段包括核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)以及質(zhì)譜(mass spectrum，MS)等聯(lián)用技術(shù)[9]。結(jié)直腸癌是遺傳、飲食、腸道炎性病變等因素綜合作用的結(jié)果，代謝組學(xué)通過探索腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的各項(xiàng)生化反應(yīng)，能夠篩選鑒定出新的腫瘤標(biāo)志物，從而為腫瘤早期診斷、分期、評(píng)估療效和預(yù)測(cè)預(yù)后等提供幫助。

1.1代謝組學(xué)技術(shù)分析平臺(tái) 目前代謝組學(xué)研究的兩大主要分析技術(shù)即核磁共振波譜和質(zhì)譜，兩種方法各有其優(yōu)劣。NMR通過核自旋、能級(jí)裂分、共振吸收特定頻率的射頻輻射來檢測(cè)不同的代謝物。NMR的優(yōu)勢(shì)在于樣品前處理較為簡(jiǎn)單，高通量，能對(duì)生物樣本進(jìn)行無創(chuàng)、無偏倚性檢測(cè)，被認(rèn)為是描述代謝物結(jié)構(gòu)的金標(biāo)準(zhǔn)，而NMR技術(shù)也存在敏感性低、樣本需求量大等缺點(diǎn)[10-11]。其中，研究最常用的檢測(cè)方法是核磁共振氫譜(Proton Nuclear Magnetic Resonance1H-NMR)。質(zhì)譜(MS)因其廣泛的動(dòng)態(tài)范圍，目前被廣泛用于代謝組學(xué)的研究。由于檢測(cè)樣本種類復(fù)雜，為了盡可能多地檢測(cè)代謝物，在質(zhì)譜分析之前往往需要進(jìn)行分離，常有GC-MS、LC-MS、CE-MS等聯(lián)用方式。 GC-MS是分析揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的有效組合，樣本一般需要進(jìn)行衍生化處理，而需檢測(cè)的代謝物往往在衍生化過程中有所損失。因此，GC-MS主要適用于有針對(duì)性的代謝組學(xué)分析[12],氣相色譜-四級(jí)-質(zhì)譜、氣相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜是GC-MS常用的方法。LC-MS可以分離熱不穩(wěn)定的、無揮發(fā)性、未衍生化的代謝物，因此，LC-MS檢測(cè)的化合物種類范圍比GC-MS更廣，適合作為未知代謝物研究中的探索辦法，但缺少代謝物數(shù)據(jù)庫是LC-MS技術(shù)的缺點(diǎn)，超高效液相色譜(ultraperformance liquid chromatography,UPLC)、電噴霧(electrospray ionization，ESI)是常用的兩種電離技術(shù)。CE對(duì)分析物的分離范圍較寬，包括小的無機(jī)離子和大分子蛋白質(zhì)[13]。毛細(xì)管電泳近年來發(fā)展較快，以其分離效率高、樣本需要量少、運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用，當(dāng)CE聯(lián)合高靈敏度的質(zhì)譜檢測(cè)器，代謝物最小檢測(cè)限會(huì)降低。但是毛細(xì)管電泳因進(jìn)樣量少，因此限制了檢測(cè)的靈敏度。由上可知，想對(duì)臨床種類、性質(zhì)各異的樣品進(jìn)行全面、無偏向性代謝組學(xué)分析，分析檢測(cè)技術(shù)需要具有高通量、高特異性、高敏感度等特點(diǎn)。目前還沒有任何一個(gè)分析平臺(tái)能夠滿足上述所有要求，因此為了自身研究需要，多平臺(tái)聯(lián)合檢測(cè)的方法日趨流行。

1.2代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺(tái) 技術(shù)分析平臺(tái)采集的原始數(shù)據(jù)不能直接用于分析，因而在統(tǒng)計(jì)分析前運(yùn)用模式識(shí)別技術(shù)對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理可以從中獲得正確有效的信息，將其變成可識(shí)別的數(shù)據(jù)模式，才能運(yùn)用于下一步的分析。根據(jù)技術(shù)平臺(tái)的變化，數(shù)據(jù)預(yù)處理主要有過濾噪聲、峰識(shí)別、譜圖去卷積、標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化等步驟，在操作中根據(jù)實(shí)際情況選擇相應(yīng)的步驟進(jìn)行即可。常用的化學(xué)計(jì)量方法主要分為兩類，包括非監(jiān)督性和有監(jiān)督性的學(xué)習(xí)方法。前者包括非線性映(nonlinear mapping，NLM)、主成分分析(principal components analysis，PCA)、自組織映射圖(self-organizing maps，SOM)等，后者常用的有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的改進(jìn)、偏最小二乘法一判別分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)、正交偏最小二乘法一判別分析(OPLS-DA)等[14-15]，PCA和PLS-DA在研究中較為常用，通過各類數(shù)據(jù)分析技術(shù)，將多維、分散的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類、歸納和總結(jié)，對(duì)組間差異代謝物可進(jìn)行初步的篩選，之后結(jié)合差異性代謝產(chǎn)物，挖掘相關(guān)的代謝調(diào)控途徑，可以為腫瘤早期診斷、分期、評(píng)估療效和預(yù)測(cè)預(yù)后等方面奠定良好基礎(chǔ)。

2 代謝組學(xué)在CRC中的研究進(jìn)展

腫瘤細(xì)胞與正常組織相比常發(fā)生代謝紊亂，其代謝旺盛，具有超強(qiáng)的增殖能力與逆境生存能力。體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的任何改變都會(huì)引起其生化反應(yīng)過程中代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，而代謝物作為腫瘤細(xì)胞生存發(fā)展過程的產(chǎn)物，能夠?qū)δ[瘤的整體狀態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷反映[16-17]。代謝組學(xué)因研究思想獨(dú)特和技術(shù)手段發(fā)展迅速的優(yōu)勢(shì)被廣泛地用于研究腫瘤領(lǐng)域，目前，國(guó)內(nèi)外已有多個(gè)專家學(xué)組對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行代謝組學(xué)研究。

2.1組織中的代謝組學(xué)研究 Phua等[18]應(yīng)用GC-TOF-MS技術(shù)對(duì)11例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和10例健康人黏膜樣本進(jìn)行分析，顯示3-磷酸甘油酸鹽(3-phosphoglycerate)、葡萄糖、檸檬酸及半乳糖在CRC患者組織樣本中的含量明顯低于健康對(duì)照組，而尿苷、肌苷(inosine)、脯氨酸等代謝物的含量升高。Williams等[19]基于分期因素對(duì)收集的結(jié)直腸癌組織與癌旁組織進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)篩選鑒定出的代謝物標(biāo)志對(duì)CRC的早期診斷及評(píng)估預(yù)后有警示作用。Tian等[20]用高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)和氣相-色譜-質(zhì)譜技術(shù)分別對(duì)50例CRC患者(分Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ ～ Ⅳ期)癌組織及相鄰的正常組織進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果顯示：相較于正常組織，膽堿、磷酸膽堿(PC)、甘油磷酸膽堿(GPC)、鯊肌醇、磷酸乙醇胺 (PE)在癌組織中含量較高，且與早期腫瘤組織相比，Ⅲ ～ Ⅳ期CRC患者癌組織中的脂質(zhì)含量高、而膽堿含量低。聯(lián)合應(yīng)用 PCA、OPLS - DA分析法，發(fā)現(xiàn)Ⅰ期癌組織與正常組織間的脂質(zhì)組學(xué)差異最大。早晚期、正常組織間脂質(zhì)含量及類型的不同，可幫助指導(dǎo)臨床CRC診斷并判別分期。楊靜[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-135b在結(jié)直腸癌患者組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且水平隨TNM分期增加而增加，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞可能與調(diào)節(jié)miR-135b表達(dá)密切相關(guān)，并且通過調(diào)節(jié)miR-135b的表達(dá)來影響CRC患者的預(yù)后。2018年有研究者對(duì)51例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行分析，其中25例轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌顯示了明顯更低百分比的二十碳五烯酸(EPA)和更高水平的γ-亞麻酸(GLA)，由此可見，脂肪酸分析對(duì)于轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌有良好的診斷價(jià)值[22]。

2.2血液中的代謝組學(xué)研究 Ritchie等[23]基于脂肪酸代謝途徑對(duì)不同區(qū)域CRC患者血清樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：CRC患者擁有較低水平的28 ～ 36含碳量的羥基化多不飽和超長(zhǎng)鏈脂肪酸。Montrose等[24]研究結(jié)直腸癌血漿標(biāo)本代謝物發(fā)現(xiàn)，肌氨酸、甘氨酸、絲氨酸和二甲基甘氨酸明顯升高，且血漿中氨基酸代謝改變發(fā)生在早癌階段。這表明氨基酸代謝通路對(duì)腫瘤細(xì)胞早期增殖分化和生存有著重要作用，因此氨基酸代謝指標(biāo)的變化可作為結(jié)直腸癌早期診斷的潛在標(biāo)志物。Zhu等[25]在對(duì)20例CRC患者連續(xù)的49份血清樣本進(jìn)行LC-MS技術(shù)分析時(shí)，共發(fā)現(xiàn)162個(gè)代謝物，其中N2、N2-二甲基鳥苷、1-甲基鳥苷、甲基丙二酸鹽、琥珀酸鹽、腺嘌呤、焦檸檬酸在疾病惡化患者血清中的水平顯著高于疾病穩(wěn)定和完全緩解者，建立由上述差異代謝物表征的模型，其受試者工作曲線、靈敏度、特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的標(biāo)志物CEA，該研究表明代謝物輪廓分析可以用于CRC病程監(jiān)測(cè)。Kühn等[26]通過LC-MS法對(duì)163例CRC患者血液標(biāo)本進(jìn)行脂質(zhì)和己糖方向的代謝組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶血磷脂膽堿(lysoPCs)表達(dá)水平越高，結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)越低，且惡性腫瘤被診斷出的時(shí)間往往比血清中脂質(zhì)代謝物變化發(fā)生要遲數(shù)年，相較于目前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物對(duì)CRC診斷及預(yù)防缺乏特異性，溶血卵磷脂可以作為早期診斷CRC的代謝指標(biāo)運(yùn)用于臨床。Nishiumi等[27]運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)分析CRC(分期為 0、Ⅰ、Ⅱ期)患者血清標(biāo)本，其中發(fā)現(xiàn)一組由丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、3-羥基異戊酸、羥基乙酸、棕櫚酸、延胡索酸色氨酸構(gòu)成的新組合。上述代謝物組合預(yù)測(cè)CRC的特異性為99.3%，敏感性為93.8%，隨腫瘤分期的增加，其敏感性、特異性逐漸降低。在一項(xiàng)涉及250例CRC血樣本的隊(duì)列研究中，發(fā)現(xiàn)包括4個(gè)有機(jī)化合物、5個(gè)有機(jī)酸、7個(gè)芳香族化合物、9個(gè)非甘油磷脂脂類、12個(gè)甘油磷酸脂類在內(nèi)的共35個(gè)代謝產(chǎn)物失調(diào)與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)[28]，結(jié)直腸癌高風(fēng)險(xiǎn)性與甘油磷酸脂類失調(diào)關(guān)系最為密切，具有診斷價(jià)值。

2.3尿液中的代謝組學(xué)研究 Chen等[29]及樊靜等[30]運(yùn)用基于MRB的CE-MS技術(shù)分析結(jié)直腸癌患者(早期8例、晚期12例)以及14例健康人尿液樣本中的9種有機(jī)酸和20種游離氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對(duì)照組相比，精氨酸、亮氨酸、纈氨酸、乳酸和異亮氨酸這5種氨基酸在腸癌患者尿液標(biāo)本中的含量較高，而蘋果酸、琥珀酸鹽、門冬氨酸、檸檬酸、組氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸含量顯著降低；隨結(jié)直腸癌病理分期的提高，纈氨酸、異亮氨酸含量逐漸降低。由此可見，結(jié)直腸癌患者與健康人之間、早期與晚期腸癌患者之間的尿液代謝輪廓差異都存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cheng等[31]收集61份CRC患者和62份正常對(duì)照者的尿液樣本，聯(lián)合運(yùn)用UPLC-QTOFMS、GC-TOFMS技術(shù)，構(gòu)建了由2氨基丁酸鹽、犬尿酸、枸櫞酸、馬尿酸鹽、腐胺、十四酸鹽和對(duì)甲酚7個(gè)代謝物組成的模型，并后續(xù)利用健康對(duì)照組和結(jié)直腸癌患者各40份的尿液樣本進(jìn)行了驗(yàn)證。該診斷模型通過ROC曲線分析，在測(cè)試組和確認(rèn)組中診斷結(jié)直腸癌的特異性與靈敏度均超過97%。有研究發(fā)現(xiàn)，肝再生磷酸酶3(PRL-3)通過誘導(dǎo)HK2、PKM2、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Glutl)和LDHA表達(dá)促進(jìn)糖酵解和減少胞內(nèi)ROS水平，在肝轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌的代謝調(diào)節(jié)中起重要作用[32]。

2.4糞便中的代謝組學(xué)研究 徐梅華等[33]利用端粒酶PCR-ELISA法分析端粒酶在健康對(duì)照者、結(jié)直腸腺瘤患者及大腸癌患者的糞便腸脫落細(xì)胞中的活性表達(dá)，結(jié)果顯示按健康對(duì)照者、結(jié)直腸腺瘤患者及大腸癌患者順序，端粒酶陽性表達(dá)率逐漸上升。由此可以看出，糞便腸脫落細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)對(duì)大腸癌的早期篩查有潛在意義。2017年有研究證實(shí)，與正常對(duì)照組相比，結(jié)直腸癌患者中熊去氧膽酸、丁酸鹽、亞油酸等水平明顯降低。2018年Ahmed等[34]研究證實(shí)，miR-135b在對(duì)照組、腺瘤組到腸癌組中的表達(dá)水平依次增加，并由此證明了糞便標(biāo)本中的miR-135b可作為晚期腺瘤和CRC診斷的代謝標(biāo)志物。Song等[35]收集糞便標(biāo)本進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腸癌患者與健康對(duì)照組的脂肪酸代謝輪廓顯著不同，提示糞便脂肪酸可以成為CRC篩查的新型工具。Bosch 2019年對(duì)11項(xiàng)研究進(jìn)行分析總結(jié)，提出短鏈脂肪酸和氨基酸在糞便氣相中水平升高，而多元醇和膽汁酸水平降低[36]。

綜上所述，CRC患者的組織、血、尿、糞便中的代謝物均發(fā)生改變，通過檢測(cè)其中各種代謝產(chǎn)物，如糖類、脂質(zhì)、脂肪酸、氨基酸和miRNA等，可篩選鑒定出差異代謝物，聯(lián)合運(yùn)用數(shù)據(jù)庫信息分析，能得到相關(guān)的紊亂代謝通路，代謝組學(xué)因自身固有優(yōu)勢(shì)在CRC臨床研究中有著良好的應(yīng)用前景。但是我們也發(fā)現(xiàn)隨著樣本種類、數(shù)量，研究人員，技術(shù)方法等因素的變化，代謝組學(xué)研究分析的結(jié)果也存在差異。標(biāo)本收集處理標(biāo)準(zhǔn)不一、無標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程、技術(shù)平臺(tái)操作復(fù)雜、數(shù)據(jù)分析軟件功能較少等局限使代謝組學(xué)的運(yùn)用還需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究探索。筆者相信隨著技術(shù)手段的不斷完善和優(yōu)化，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行研究分析會(huì)出現(xiàn)更多的成果，從而為腫瘤診斷、分期、評(píng)估療效和預(yù)測(cè)預(yù)后等提供更多的信息和幫助。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。