林松斌，馮青陽(yáng)，許劍民

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門(mén)醫(yī)院普外科，福建 廈門(mén) 361000；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，上海 200032）

結(jié)腸直腸癌是世界常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。在我國(guó)，結(jié)腸直腸癌發(fā)病率與死亡率逐年上升，均位居惡性腫瘤第5位，正逐步接近發(fā)達(dá)國(guó)家[2-3]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)腸直腸癌病人死亡的主要原因。對(duì)于初診無(wú)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸直腸癌病人，行原發(fā)灶根治術(shù)后，10%～25%的病人出現(xiàn)異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4-5]。手術(shù)是治療異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的最佳手段，早期發(fā)現(xiàn)是達(dá)成手術(shù)切除的關(guān)鍵[6]。然而，異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移潛伏期較長(zhǎng)，缺乏臨床癥狀，難以發(fā)現(xiàn)。因此，研究預(yù)測(cè)異時(shí)性轉(zhuǎn)移的有效手段成為改善結(jié)腸直腸癌預(yù)后的重點(diǎn)。

多項(xiàng)研究已證實(shí)，RAS-RAF-MAPK信號(hào)通路在結(jié)腸直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用[7-9]。同時(shí)，KRAS基因也是抗EGFR治療能否起效的重要預(yù)測(cè)標(biāo)志[10-12]。既往KRAS突變與異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的報(bào)道較少。本研究比較原發(fā)灶根治術(shù)后無(wú)轉(zhuǎn)移病人與發(fā)生異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病人的臨床病理特征及KRAS基因型的差異，尋找預(yù)測(cè)異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，并建立多因素模型，提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。

材料與方法

一、研究人群

回顧性選取2002年1月至2008年12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科手術(shù)切除的結(jié)腸直腸癌病人。包括如下條件：18～75歲；初診影像學(xué)檢查明確無(wú)同時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；原發(fā)灶根治性切除；術(shù)后病理檢查確診結(jié)腸直腸癌；術(shù)前未接受化療、放療或介入治療；病程中未接受靶向治療。依據(jù)病人原發(fā)灶切除術(shù)后是否出現(xiàn)異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，分為無(wú)轉(zhuǎn)移組和轉(zhuǎn)移組。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移定義為肝、肺、骨、腦等遠(yuǎn)處臟器的轉(zhuǎn)移，包括鎖骨下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但不包括盆腔淋巴結(jié)、腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹膜播散。同時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移定義為初診即發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移及原發(fā)灶根治術(shù)后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移定義為原發(fā)灶根治術(shù)6個(gè)月后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。所有病人原發(fā)灶根治性切除術(shù)后均依據(jù)《衛(wèi)生部結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2017年版）》接受輔助治療。僅出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后，可應(yīng)用經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞和經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈灌注化療。

二、KRAS基因檢測(cè)

選取原發(fā)灶根治性切除術(shù)后標(biāo)本，經(jīng)甲醛固定和石蠟包埋，連續(xù)切片。采用基因科技（上海）有限公司“GTpure FFPE DNA kit”抽提，制備DNA模板。采用PCR擴(kuò)增KRAS第2外顯子12密碼子和13密碼子片段。應(yīng)用焦磷酸法測(cè)序（PyroMark ID system,PSQ 96 MA,Biotage AB,Sweden），檢測(cè)相應(yīng)突變。

三、隨訪(fǎng)

病人依據(jù)《衛(wèi)生部結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2017年版）》進(jìn)行隨訪(fǎng)。術(shù)后2年內(nèi)，每3～6個(gè)月1次病史詢(xún)問(wèn)、體格檢查、腫瘤標(biāo)志物檢查、肝臟超聲檢查。術(shù)后2～5年，上述檢查每6個(gè)月1次。術(shù)后5年內(nèi)，每年1次胸、腹和盆腔增強(qiáng)CT掃描。復(fù)查結(jié)腸鏡為術(shù)后1年內(nèi)、第3年，以后每5年1次。懷疑肝轉(zhuǎn)移的病人加行MRI檢查，必要時(shí)行PET-CT檢查。若發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，則追溯前一次檢查結(jié)果，以明確轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)的確切時(shí)間。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)于分類(lèi)變量，采用χ2檢驗(yàn)。如理論頻數(shù)＜5或樣本量＜40，則采用Fisher精確檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，采用Log-Rank比較差異。單因素/多因素分析采用Logistic回歸計(jì)算比數(shù)比(odds ratio，OR)和相應(yīng)的95%CI。中位隨訪(fǎng)時(shí)間依據(jù)Schemper等[13]的報(bào)道進(jìn)行計(jì)算。預(yù)測(cè)模型采用Logistic回歸Backward Stepwise法建立，采用R軟件繪制列線(xiàn)圖 (Nomogram)，應(yīng)用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線(xiàn)進(jìn)行內(nèi)部效能檢驗(yàn)，曲線(xiàn)下面積（area under the curve,AUC）＞0.7認(rèn)為模型預(yù)測(cè)效能較好。其他統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用 SPSS 16.0軟件。P值為雙側(cè)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將P＜0.1的因素納入多因素分析。

結(jié) 果

一、KRAS基因突變情況

本研究隨機(jī)納入病人186例，按轉(zhuǎn)移組與無(wú)轉(zhuǎn)移組1∶1分組，其中無(wú)轉(zhuǎn)移組93例，轉(zhuǎn)移組93例。病人中位隨訪(fǎng)時(shí)間86個(gè)月，其中無(wú)轉(zhuǎn)移組88個(gè)月，轉(zhuǎn)移組84個(gè)月。無(wú)轉(zhuǎn)移組KRAS基因野生型68例（73.1%）；突變型25例（26.9%）。轉(zhuǎn)移組 KRAS 基因野生型49例（52.7%）；突變型44例（47.3%）。檢測(cè)到病人7種KRAS基因突變類(lèi)型，均為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）。其中，KRAS第2外顯子12密碼子突變類(lèi)型（6種）為c.35G ＞A,p.G12D；c.35G ＞T,p.G12V；c.34G ＞T,p.G12C；c.35G＞C,p.G12A；c.34G＞A,p.G12S；c.34G＞C,p.G12R。KRAS第2外顯子13密碼子突變類(lèi)型（1 種）為 c.38G＞A,p.G13D。全體突變互斥，未檢測(cè)到多重突變（見(jiàn)表1）。

表1 KRAS基因突變情況[n（%）]

二、KRAS基因突變與臨床病理因素的相關(guān)性

對(duì)KRAS基因突變類(lèi)型與臨床病理因素進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，KRAS基因突變與原發(fā)灶根治術(shù)前 CEA(P=0.015)和異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P＜0.001)顯著相關(guān)，與術(shù)后pN分期潛在相關(guān)(P=0.073)（見(jiàn)表2）。

表2 KRAS突變類(lèi)型與臨床病理因素的相關(guān)性[n（%）]

三、KRAS基因突變是發(fā)生異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素

進(jìn)一步對(duì)不同的臨床病理因素及KRAS基因突變類(lèi)型與結(jié)腸直腸癌的異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進(jìn)行了單因素及多因素分析。其中單因素分析結(jié)果顯示，原發(fā)灶病理類(lèi)型為黏液腺癌與異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生時(shí)間呈潛在負(fù)相關(guān) (OR=0.490，95%CI：0.220～1.090，P=0.080)，術(shù)后病理 N2 分期與異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生時(shí)間呈潛在正相關(guān) (OR=2.134，95%CI：0.993～4.585，P=0.052)。KRAS 基因c.35G＞T,p.G12V 突變型(OR=4.163，95%CI：1.267～13.681，P=0.019) 和 c.38G＞A，p.G13D 突變型 (OR=7.286，95%CI：2.352～22.567，P=0.001)與異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。多因素分析顯示，女性(OR=0.426,95%CI：0.207～0.876,P=0.020)、 原發(fā)灶位于直腸(OR=0.408，95%CI：0.173～0.961，P=0.040)、原發(fā)灶組織學(xué)類(lèi)型黏液腺癌 (OR=0.230,95%CI：0.075～0.709，P=0.010) 是異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立保護(hù)因素。術(shù)后 pN2 分期(OR=4.191，95%CI：1.643～10.691，P=0.003)、KRAS 基因 c.35G＞T，p.G12V 突變型(OR=10.568，95%CI：2.568～43.499，P=0.001)和 c.38G＞A，p.G13D 突變型 (OR=12.657，95%CI：3.607～44.411，P＜0.001)是異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（見(jiàn)表3）。

表3 異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移單因素/多因素分析

對(duì)轉(zhuǎn)移組病人轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)間的分析顯示，異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生的中位時(shí)間為16個(gè)月，四分位數(shù)間距 (interquartile range,IQR)=10～28個(gè)月。其中，KRAS野生型病人轉(zhuǎn)移中位時(shí)間為18個(gè)月，IQR=12～31 個(gè)月；c.35G＞A，p.G12D 突變型中位時(shí)間為11 個(gè)月，IQR=9～28 個(gè)月；c.35G＞T，p.G12V 突變型中位時(shí)間為 15 個(gè)月，IQR=8～34 個(gè)月；c.38G＞A，p.G13D突變型中位時(shí)間為13個(gè)月，IQR=9～19個(gè)月。KRAS基因 c.38G＞A，p.G13D 突變型相比野生型，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生中位時(shí)間潛在較短(P=0.066)，其余基因型之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖1）。本研究KRAS基因p.G13D突變病人發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)間較野生型病人潛在較短（13 個(gè)月比 18 個(gè)月,P=0.066）。p.G12D 突變病人與野生型病人相比，發(fā)生轉(zhuǎn)移的中位時(shí)間雖更短（11個(gè)月比18個(gè)月），但由于樣本量有限，差異未能得出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.264），有待擴(kuò)大樣本量，開(kāi)展進(jìn)一步研究。

圖1 不同KRAS基因型病人異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生中位時(shí)間

四、多因素模型預(yù)測(cè)異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

以多因素分析結(jié)果為基礎(chǔ)建立預(yù)測(cè)模型，最終納入5個(gè)因素：性別、原發(fā)灶部位、原發(fā)灶組織學(xué)類(lèi)型、術(shù)后pN分期和KRAS基因突變類(lèi)型。建模因素均為異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素。繪制相應(yīng)列線(xiàn)圖模型（見(jiàn)圖2）。

圖2 異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移多因素預(yù)測(cè)模型

ROC曲線(xiàn)檢驗(yàn)TNM分期預(yù)測(cè)異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，AUC=0.569，95%CI：0.487～0.652（見(jiàn)圖3）。KRAS基因類(lèi)型單獨(dú)預(yù)測(cè)異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，AUC=0.628,95%CI：0.548～0.709。多因素預(yù)測(cè)模型內(nèi)部效能檢驗(yàn)，AUC=0.767,95%CI：0.700～0.834。結(jié)果顯示，該多因素模型內(nèi)部預(yù)測(cè)性能良好，顯著優(yōu)于TNM分期(P＜0.001)和 KRAS 基因類(lèi)型(P＜0.001)單個(gè)因素預(yù)測(cè)（見(jiàn)圖3）。

圖3 預(yù)測(cè)模型內(nèi)部效能檢驗(yàn)

討 論

本研究顯示，KRAS基因突變以 c.35G＞A,p.G12D；c.35G＞T,p.G12V 和 c.38G＞A,p.G13D 三種類(lèi)型為主。其中，c.35G＞A,p.G12D 與異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性；c.35G＞T,p.G12V 和 c.38G＞A,p.G13D均是異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以性別、原發(fā)灶的部位和組織學(xué)類(lèi)型、術(shù)后pN分期和KRAS基因突變類(lèi)型共5個(gè)因素建立多因素預(yù)測(cè)模型，可有效預(yù)測(cè)原發(fā)灶根治術(shù)后異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

KRAS基因突變主要表現(xiàn)為SNP[14-15]。除外無(wú)氨基酸表達(dá)改變的無(wú)意義突變，KRAS基因SNP通過(guò)關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的改變影響KRAS表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而影響其生物學(xué)功能。本研究顯示，KRAS第2 外顯子 12 密碼子發(fā)生 c.35G＞A,p.G12D 突變后，盡管氨基酸發(fā)生改變，但在腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面影響并不顯著；然而c.35G＞T,p.G12V突變顯著提高異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。因此，即使是同一位點(diǎn)的突變，突變類(lèi)型不同，也會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)性狀不同。提示在個(gè)體化治療中，不應(yīng)以突變基因位點(diǎn)簡(jiǎn)單區(qū)分病人，而應(yīng)關(guān)注突變基因的具體生物學(xué)性狀。

本研究也存在缺陷。首先，納入樣本量較少，未包含KRAS的全部突變類(lèi)型，且部分突變種類(lèi)頻率較低，未進(jìn)行有效的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其次，建立的多因素預(yù)測(cè)模型僅接受內(nèi)部驗(yàn)證，尚需外部驗(yàn)證以明確其預(yù)測(cè)效能。第三，眾所周知，結(jié)腸直腸癌是一種多基因相關(guān)的惡性腫瘤，僅檢測(cè)單個(gè)KRAS基因無(wú)法精確預(yù)測(cè)疾病進(jìn)程。這是今后研究的又一個(gè)方向。

本研究證實(shí)，KRAS 基因 c.35G＞T,p.G12V 和c.38G＞A,p.G13D 突變是異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究建立的多因素預(yù)測(cè)模型較好地預(yù)測(cè)結(jié)腸直腸癌原發(fā)灶根治術(shù)后異時(shí)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生。模型還需多中心、大樣本驗(yàn)證，進(jìn)一步明確其有效性與適用范圍。