王曉元 趙軼峰 楊永江 黃 迪 蘇卓彬 李 坤 李晶晶 李曙光

結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者的主要死因[1]。目前臨床上常用的結(jié)腸癌治療方法主要是手術(shù)切除、放射治療和化學(xué)治療[2]。近年來隨著對(duì)結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的深入研究，有望通過調(diào)控抑癌基因或促癌基因來影響結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，為改善療效和患者的預(yù)后提供新的思路和靶點(diǎn)[3]。

Notch1在包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的細(xì)胞和組織發(fā)育過程中起著重要作用。近年來研究表明，Notch1與包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系緊密。Ishiguro等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中Notch1可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖。

微RNA(miRNA)是非編碼RNA家族的一員，miRNA的發(fā)現(xiàn)為探究疾病發(fā)生的分子機(jī)制提供了新的方向。眾多研究表明miRNA可通過靶向癌基因、抑癌基因或其他與腫瘤細(xì)胞増殖、血管生成及腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行調(diào)控。結(jié)腸癌患者存在多種miRNA的異常表達(dá)，如Eldaly等[5]發(fā)現(xiàn)miR-576-3p、miR-613在結(jié)腸癌患者血清中表達(dá)降低；Yan等[6]發(fā)現(xiàn)miR-182-5p可通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)抑制結(jié)腸癌的發(fā)生、血管生成和淋巴管生成。前期研究經(jīng)軟件預(yù)測得知Notch1可能是miR-383的潛在靶基因，有研究顯示上調(diào)miR-383表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[7]，但具體機(jī)制尚未明確。本研究觀察了miR-383對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并分析了在此過程中Notch1所起的作用，以期揭示miR-383在結(jié)腸癌中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2017年4月至2020年3月在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診為結(jié)腸癌的74例患者，收集其經(jīng)手術(shù)切除的腫瘤組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>3 cm)。所有患者術(shù)前均未接受放射治療或化學(xué)治療。BALB/c裸鼠由本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，LipofectamineTM2000 試劑、逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒、ECL檢測試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Transwell 小室購自美國Corning公司，抗體、CCK8檢測試劑盒均購自英國Abcam公司。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞在添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于5%CO2、37 ℃的恒溫箱中。

1.2.2 結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116轉(zhuǎn)染及分組 根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000的說明書，待HCT116細(xì)胞生長融合度達(dá)80%時(shí)，將其分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(NC)、miR-383模擬物、Notch1及共轉(zhuǎn)染miR-383模擬物+Notch1，對(duì)應(yīng)分為miR-NC組、miR-383 組、Notch1組及miR-383+Notch1組；另設(shè)一空白對(duì)照組。

1.2.3 生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 利用TargetScan在線分析Notch1與miR-383靶向關(guān)系。構(gòu)建野生型或突變型Notch1的報(bào)告基因載體，將miR-383與野生型或突變型Notch1的報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.2.4 qRT-PCR檢測 使用TRIzol試劑從細(xì)胞系或組織中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA合成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，miR-383 mRNA的表達(dá)水平以U6為內(nèi)參，Notch1 mRNA的表達(dá)水平以GAPDH為內(nèi)參，miR-383轉(zhuǎn)染組HCT116細(xì)胞中及結(jié)腸癌組織中的Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct表示。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western Blot檢測 提取HCT116細(xì)胞或結(jié)腸癌組織蛋白，測定蛋白水平，采用12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。加入一抗Notch1抗體及內(nèi)參GAPDH，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h。ECL液暗室發(fā)光顯影，采集圖像并分析。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測 石蠟切片置于65 ℃烤箱中過夜，梯度脫蠟、水化。加入3% H2O2溶液室溫孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。使用微波加熱法修復(fù)抗原。加入5%正常羊血清封閉，37 ℃孵育15 min。加入一抗Notch1抗體或Ki67抗體，4 ℃過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗，37 ℃孵育30 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。采用DAB顯色后，蘇木素染液染色2 min，隨后脫水，中性樹脂封片。采用正置顯微鏡放大500倍觀察切片。

1.2.7 CCK8法檢測 用CCK8試劑檢測各組HCT116細(xì)胞的增殖能力。HCT116細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度接種在96孔板，培養(yǎng)24 h后，向每孔加入10 μL CCK8，然后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。

1.2.8 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 調(diào)整HCT116細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。在上室加入100 μL細(xì)胞懸液，在下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室后用PBS淋洗3次，將小室置于95%乙醇中固定5 min，在0.5%結(jié)晶紫染液中染色10 min后，用PBS漂洗去除未結(jié)合細(xì)胞的染液。

1.2.9 結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型制備 選取BALB/c裸鼠6只，約5周齡，體質(zhì)量13～17 g，飼養(yǎng)于22 ℃、40%～75%濕度、12 h晝夜交替循環(huán)條件下，自由獲取水和食物。將裸鼠隨機(jī)分為miR-NC模型組(n=3)和miR-383模型組(n=3)。HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-383模擬物后，配置成約1×107個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，接種于裸鼠左側(cè)腋下處皮下(0.2 mL/只)，3周后采用頸椎脫臼法處死全部裸鼠，剝離瘤體，稱重，拍照，甲醛固定。

2 結(jié)果

2.1 miR-383與Notch1的調(diào)控關(guān)系

TargetScan生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果如圖1所示，Notch1的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)序列上存在連續(xù)的miR-383結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-383組的Notch1野生型質(zhì)粒熒光素酶活性較miR-NC組明顯降低(20.07±0.12比13.61±0.19，P<0.01)；miR-383組與miR-NC組的Notch1突變型質(zhì)粒熒光素酶的活性無明顯差異(20.09±0.13比20.02±0.07，P>0.05)；見圖2。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與miR-NC組HCT116細(xì)胞中miR-383 mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.00±0.08比1.09±0.11，P>0.05)；與miR-NC組相比，miR-383組HCT116細(xì)胞中miR-383 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(1.09±0.11比4.45±0.17，P<0.01)，表明miR-383模擬物轉(zhuǎn)染成功；隨后的qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-383組HCT116細(xì)胞中Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(1.00±0.12比0.57±0.09，P<0.01)；Western Blot結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-383組HCT116細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)水平明顯降低(1.00±0.21比0.41±0.04，P<0.01)；見圖3。上述結(jié)果表明miR-383通過直接靶向作用于Notch1，從而抑制其mRNA和蛋白的表達(dá)。

圖1 TargetScan軟件預(yù)測圖

注：與miR-NC組相比較，**P<0.01

注：與miR-NC組比較，**P<0.01

2.2 結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中Notch1表達(dá)的比較

采用免疫組織化學(xué)法檢測Notch1在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中Notch1蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，見圖4。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平較癌旁正常組織明顯升高(1.96±0.14比1.00±0.08，P<0.01)，Western blot結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中Notch1蛋白表達(dá)水平較癌旁正常組織明顯升高(1.97±0.05比1.00±0.12，P<0.01)，見圖5。

圖4 結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中Notch1蛋白表達(dá)的比較 蘇木素染色 ×500 A 癌旁正常組織 B 結(jié)腸癌組織

注：與癌旁正常組織比較，**P<0.01

2.3 miR-383和Notch1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

采用CCK8法檢測4組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的增殖情況，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，Notch1組細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)(1.61±0.13比2.17±0.12)，miR-383組細(xì)胞的增殖能力明顯減弱(1.61±0.13比1.08±0.11)，miR-383+Notch1組細(xì)胞的增殖能力較miR-383組明顯增強(qiáng)(1.08±0.11比1.94±0.14)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，見圖6。采用Tranwell實(shí)驗(yàn)檢測4組細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，Notch1組細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，miR-383組細(xì)胞的遷移能力明顯減弱，miR-383+Notch1組細(xì)胞的遷移能力較miR-383組明顯增強(qiáng)，見圖7。上述結(jié)果表明，miR-383可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，過表達(dá)Notch1能逆轉(zhuǎn)這種抑制效果。

注：與miR-NC組比較，aP<0.01；與miR-NC組比較，bP<0.01；與miR-383組比較，cP<0.01

圖7 miR-383和Notch1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響 結(jié)晶紫染色 ×400 A miR-NC組 B Notch1組 C miR-383組 D miR-383+Notch1組

2.4 miR-383在結(jié)腸癌移植瘤裸鼠模型中對(duì)腫瘤生長的影響

利用轉(zhuǎn)染了miR-NC或miR-383 模擬物的HCT116細(xì)胞構(gòu)建結(jié)腸癌移植瘤裸鼠模型，21 d后剝離腫瘤并稱重，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，miR-383模型組腫瘤組織中Ki67和Notch1蛋白表達(dá)水平均明顯低于miR-NC模型組(圖8)。與miR-NC模型組相比，miR-383模型組的腫瘤體積明顯縮小，腫瘤體質(zhì)量明顯降低(圖9)。Western Blot結(jié)果也顯示，與miR-NC模型組相比，miR-383模型組的Notch1蛋白表達(dá)明顯降低(圖10)。上述結(jié)果表明，在結(jié)腸癌移植瘤裸鼠模型中，miR-383通過靶向調(diào)控Notch1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。

圖8 miR-383在結(jié)腸癌移植瘤裸鼠模型中對(duì)腫瘤生長的影響 蘇木素染色 ×500 A miR-NC模型組的Ki67蛋白表達(dá) B miR-383模型組的Ki67蛋白表達(dá) C miR-NC模型組的Notch1蛋白表達(dá) D miR-383模型組的Notch1蛋白表達(dá)

圖9 兩組的腫瘤大體標(biāo)本對(duì)比

圖10 兩組Notch1蛋白表達(dá)的比較

3 討論

結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)，凋亡率較低，對(duì)化學(xué)治療、放射治療和生物治療的耐藥性較強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤惡性生長，切除后復(fù)發(fā)率較高[8-9]。研究已證實(shí)miRNA的異常表達(dá)可調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖等重要的生物學(xué)行為。Qu等[10]的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-374b可通過調(diào)控LRH-1/Wnt信號(hào)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲；Lu等[11]的研究發(fā)現(xiàn)miR-17-3P可通過靶向調(diào)控Par4影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖；Feng等[12]的研究發(fā)現(xiàn)miR-590-3p可通過抑制WIF1和DKK1激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。但目前關(guān)于miR-383在結(jié)腸癌中作用機(jī)制的研究較少，有研究顯示miR-383可通過調(diào)控CREPT在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌作用[13]。目前研究表明，一種miRNA可調(diào)控多種靶mRNA，而多種miRNA也可調(diào)控一種靶mRNA，從而構(gòu)成了錯(cuò)綜復(fù)雜的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了深入探究mR-383在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制，本研究中CCK8和Tranwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-383模擬物后，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力較miR-NC組均明顯減弱，表明miR-383可能具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的作用。

研究表明，miRNA在基因調(diào)控的過程中，通過調(diào)節(jié)靶基因的蛋白表達(dá)水平，廣泛參與各種生物過程和人類疾病的發(fā)生、發(fā)展，因此miRNA靶基因的鑒定成為破解miRNA生物學(xué)功能的主要手段[14-15]。為進(jìn)一步分析miR-383在結(jié)腸癌中的作用，本研究采用TargetScan篩選miR-383的潛在靶基因，結(jié)果顯示miR-383在Notch1的3′-UTR上具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)該預(yù)測進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-383可與Notch1的3′-UTR互補(bǔ)結(jié)合。進(jìn)一步的檢測結(jié)果顯示miR-383 模擬物可抑制Notch1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，表明miR-383能直接靶向作用于Notch1。

Notch1不僅對(duì)正常細(xì)胞的分化有重要作用，而且可作為促癌基因或抑癌基因，對(duì)一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等生物過程也起著調(diào)控作用。Notch信號(hào)通路在許多惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)[16]，Zhang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)Notch 信號(hào)通路的異常激活與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)。本研究檢測了Notch1在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中Notch1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均較癌旁正常組織明顯升高(P均<0.01)，提示Notch1異常表達(dá)可能與結(jié)腸癌關(guān)系密切，這與以往的研究結(jié)果類似。此外，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察Notch1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)上調(diào)Notch1的表達(dá)水平能促進(jìn)HCT116細(xì)胞的增殖和遷移，并且轉(zhuǎn)染miR-383模擬物的細(xì)胞過表達(dá)Notch1后，miR-383對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的抑制效果會(huì)被逆轉(zhuǎn)，這提示Notch1是miR-383抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的重要靶點(diǎn)。Ki67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原可用于判斷腫瘤的惡性程度，Ki67水平越高，提示腫瘤細(xì)胞增殖越活躍，腫瘤生長越快。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-383在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移瘤裸鼠模型中的作用與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，miR-383過表達(dá)的裸鼠腫瘤組織中Notch1蛋白的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞增殖能力明顯低于miR-NC模型組，并且腫瘤的體積縮小，體質(zhì)量也明顯降低，表明miR-383能抑制裸鼠腫瘤的生長。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Notch1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。miR-383能通過負(fù)性調(diào)控其靶基因Notch1的表達(dá)發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用，并可抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移瘤裸鼠模型的腫瘤生長。本研究揭示了miR-383在結(jié)腸癌中發(fā)揮著抑癌因子的作用，Notch1是其作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。