郟 鵬 潘 冰 汪 洋 趙武華

結(jié)直腸癌是中國常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和病死率分別居惡性腫瘤的第3位和第4位，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移是其高病死率的主要原因[1-2]。微RNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[3]。miRNA通過與信使RNA(mRNA)靶標(biāo)的3′-UTR互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制蛋白質(zhì)合成，可參與多種消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生、進(jìn)展[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在結(jié)直腸癌組織及正常組織中存在差異性表達(dá)，并與患者生存率密切相關(guān)[6-7]。目前關(guān)于miR-100表達(dá)對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響存在不一致的結(jié)論，張善信等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-100雖然具有抑癌作用，但其表達(dá)水平對結(jié)直腸癌患者的總體生存率并無顯著影響；Chen等[9]則認(rèn)為，miR-100低表達(dá)患者的總體生存期較短。方志雄等[10]將miR-99a導(dǎo)入肝癌HepG2細(xì)胞，通過細(xì)胞生長曲線與平皿克隆實驗觀察發(fā)現(xiàn)，miR-99a高表達(dá)后肝癌細(xì)胞的生長速度明顯減慢，增殖能力降低，提示miR-99a在肝細(xì)胞癌中可能發(fā)揮著抑癌作用。目前關(guān)于miR-99a在原發(fā)性結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)水平及臨床意義的報道較少。本文探究了miR-99a、miR-100在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為進(jìn)一步研究其在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能，以及篩選相關(guān)下游靶基因奠定基礎(chǔ)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2014年1月至2019年1月臺州市第一人民醫(yī)院收治的84例結(jié)直腸癌患者作為研究對象，所有患者行結(jié)直腸癌根治術(shù)治療，手術(shù)結(jié)束后，在不影響病理診斷取材需要的前提下采集組織樣本。收集患者的腫瘤組織、癌旁組織及正常組織，癌旁組織距離腫瘤組織約1 cm，正常組織取自距腫瘤組織5 cm以上的手術(shù)標(biāo)本。采集組織樣本后，將組織樣本迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80 ℃冰箱，這一過程均在手術(shù)標(biāo)本離體后30 min內(nèi)完成。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均符合《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017年版)》中有關(guān)結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]；(2)均行根治性手術(shù)治療；(3)首次診斷并治療；(4)術(shù)前未行放射、化學(xué)治療等抗腫瘤治療；(5)病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)者；(2)合并其他急慢性感染性疾??；(3)合并全身其他系統(tǒng)的惡性腫瘤；(4)依從性差，隨訪資料不全。84例患者中，男性51例，女性33例，年齡為45～78歲，平均年齡為(61.5±5.8)歲。收集患者的病歷資料及手術(shù)相關(guān)記錄，納入患者性別、年齡、分化程度、組織學(xué)類型、浸潤深度、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke′s分期等指標(biāo)。

1.2 組織中miR-99a、miR-100表達(dá)水平的檢測

患者組織標(biāo)本保存于本院實驗室或病理科，每份樣品均包括結(jié)直腸癌組織、癌旁組織和正常組織。將液氮中的標(biāo)本進(jìn)行研磨，使用TRIzol試劑盒(購自美國智雅生物技術(shù)有限公司)提取標(biāo)本中的總RNA，使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自日本Takara公司)合成cDNA，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-99a、miR-100的相對表達(dá)量，試劑盒購自美國Abcam公司。引物由武漢博士德生物工程有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體積為20 μL，95 ℃加熱3 min滅活殘余蛋白酶，之后設(shè)置反應(yīng)參數(shù)95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，總計40個循環(huán)，設(shè)置4個重復(fù)孔。以U6作為內(nèi)參，計算Ct值，采用2-△△Ct表示各組織中miR-99a、miR-100的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 隨訪

采用門診或電話的形式進(jìn)行隨訪。術(shù)后每3個月門診隨訪1次，之后每6個月隨訪1次，直至隨訪終點(diǎn)或失訪?？偵嫫?OS)定義為從隨機(jī)化開始至因任何原因死亡的時間。隨訪截止時間為2019年12月31日。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-99a、miR-100在結(jié)直腸組織中的表達(dá)水平

結(jié)果顯示，miR-99a在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織、正常組織中的相對表達(dá)量分別為3.15±1.52、5.98±1.73、8.63±1.98，miR-100的相對表達(dá)量分別為2.86±1.05、5.64±1.47、8.52±1.56。miR-99a、miR-100在結(jié)直腸癌組織中的相對表達(dá)量顯著低于癌旁組織及正常組織，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 miR-99a、miR-100在結(jié)直腸患者組織中的表達(dá)水平 A miR-99a B miR-100

2.2 miR-99a、miR-100的表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

單因素分析顯示，與腫瘤浸潤深度≥T2期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，Duke′s分期為C、D期者相比較，腫瘤浸潤深度為T1期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、Duke′s分期為A、B期患者的miR-99a、miR-100相對表達(dá)量均較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 miR-99a、miR-100表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 影響患者復(fù)發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移的Cox多因素分析

隨訪發(fā)現(xiàn)，84例患者中23例出現(xiàn)了腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，發(fā)生率為27.4%。

以miR-99a的中位相對表達(dá)量(3.19)為標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為miR-99a低表達(dá)組和高表達(dá)組；以miR-100的中位相對表達(dá)量(2.85)為標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為miR-100低表達(dá)組和高表達(dá)組。Cox生存回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Duke′s分期、miR-99a、miR-100是影響患者復(fù)發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響患者復(fù)發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移的Cox多因素分析

2.4 miR-99a、miR-100的表達(dá)水平對患者OS的影響

生存分析Log-rank檢驗結(jié)果顯示，miR-99a低表達(dá)組的OS顯著低于miR-99a高表達(dá)組(χ2=7.56，P<0.001)，miR-100低表達(dá)組的OS顯著低于miR-100高表達(dá)組(χ2=13.35，P<0.001)，即miR-99a、miR-100表達(dá)水平越低，患者預(yù)后越差。見圖2。

圖2 miR-99a、miR-100的表達(dá)水平對患者OS的影響 A miR-99a B miR-100

3 討論

結(jié)直腸癌是世界上發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬人被診斷為結(jié)直腸癌[12]，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。轉(zhuǎn)移是指細(xì)胞從原發(fā)腫瘤向非鄰近器官擴(kuò)散并形成繼發(fā)腫瘤的多步驟過程。這一過程包括原發(fā)腫瘤的生長、血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲、淋巴管/血管內(nèi)滲、遠(yuǎn)處器官滲出以及轉(zhuǎn)移瘤的定植和生長[13]。由于及時治療處于非轉(zhuǎn)移期的結(jié)直腸癌患者可以提高生存率，因此，深入了解結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子途徑，開發(fā)新的預(yù)后分子標(biāo)志物，有助于減少結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。miRNA在細(xì)胞的遷移、增殖、分化和凋亡等多個生理過程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)[14-15]。miRNA可能在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的各個階段發(fā)揮作用，包括血管生成、侵襲、內(nèi)滲、循環(huán)、外滲和轉(zhuǎn)移定植等，已有報道指出多種miRNA可作為預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后的標(biāo)志物[16]。

在絕大多數(shù)惡性腫瘤中存在miRNA的異常表達(dá)，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮促癌作用或抑癌作用。本研究結(jié)果顯示，miR-99a、miR-100在結(jié)直腸癌組織中的相對表達(dá)量顯著低于癌旁組織和正常組織，提示miR-99a和miR-100在結(jié)直腸癌組織中可能發(fā)揮抑癌作用。此外，研究結(jié)果顯示，在正常組織、癌旁組織、結(jié)直腸癌組織中，miR-99a及miR-100的表達(dá)水平依次降低，提示結(jié)直腸癌細(xì)胞具有更高的侵襲表型，這可能與miR-99a、miR-100啟動子區(qū)域的高甲基化導(dǎo)致兩者表達(dá)降低有關(guān)[17-18]。本研究對患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-99a、miR-100的相對表達(dá)量越低，則患者的浸潤深度越大、Duke′s分期越高，越易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示隨著miR-99a、miR-100表達(dá)水平的降低，腫瘤生物學(xué)行為的惡性程度越高。

在結(jié)直腸癌中，腫瘤細(xì)胞從腫塊中解離，穿過基底膜，到達(dá)血管/淋巴管的確切機(jī)制尚不清楚。有報道指出，miR-99a在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中可通過降低PI3K/AKT/mTOR信號通路活性抑制細(xì)胞增殖，阻滯G1/S期轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長[19]。Fujino等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-100在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著降低，可用于預(yù)測早期結(jié)直腸癌是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。以上研究均提示，miR-99a與miR-100在惡性腫瘤中可能更多地發(fā)揮著抑癌作用，當(dāng)兩者表達(dá)下調(diào)時，可導(dǎo)致腫瘤形成的抑制性機(jī)制部分失靈，提高了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究隨訪發(fā)現(xiàn)，miR-99a低表達(dá)組、miR-100低表達(dá)組患者的總體生存率均顯著高于相應(yīng)的高表達(dá)組，即miR-99a、miR-100的表達(dá)水平越高，患者預(yù)后情況越好。推測這是由于高表達(dá)miR-99a、miR-100患者的臨床病理參數(shù)更為理想，腫瘤侵襲性相對較低，致使患者的總體生存率相對更理想。

綜上所述，miR-99a和miR-100在結(jié)直腸癌患者組織中的表達(dá)水平明顯降低，提示其具有潛在的抑癌作用。但本研究的樣本量較小，今后應(yīng)在增加樣本量的基礎(chǔ)上，實施更大規(guī)模的研究，或能得出更具說服力的結(jié)論。