劉國(guó)興，胡玉立，徐丹丹，徐 松

（國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司 湖北，武漢 430075）

萊茵衣藻是一種生活在淡水里的單細(xì)胞真核綠藻，其葉綠體表達(dá)的外源蛋白具有安全性好、培養(yǎng)周期短、遺傳穩(wěn)定、容易擴(kuò)大培養(yǎng)，并且成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[1,2,3]。近些年來，多種具有應(yīng)用前景的蛋白在萊茵衣藻葉綠體中成功表達(dá)[4]。而一般構(gòu)建衣藻葉綠體表達(dá)載體需要通過兩步克隆來完成：首先將外源基因插入克隆載體的衣藻來源的5’和3’非翻譯區(qū)（UTR）多克隆位點(diǎn)間，再將5’UTR-外源基因-3’UTR的表達(dá)盒酶切下，通過同源重組構(gòu)建至表達(dá)載體[5,6]。為了簡(jiǎn)化衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建步驟，本研究構(gòu)建了一種T載體pBTNK，通過一步TA克隆可將待表達(dá)的外源基因插入衣藻來源5’和3’UTR 之間，藍(lán)白斑篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子后，重組質(zhì)粒可直接用于轉(zhuǎn)化植物，因此可簡(jiǎn)化衣藻葉綠體中表達(dá)載體構(gòu)建流程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藻株、菌株和質(zhì)粒 萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii137c (mt)、質(zhì)粒 pCX16、pCX13、p228 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳杏洲博士惠贈(zèng)；大腸桿菌DH10β，質(zhì)粒pShuttle、pFAST-EGFP、pT-BASIC由湖北大學(xué)蔣思婧博士惠贈(zèng)。

1.1.2 酶、主要試劑和設(shè)備 BfuI 購(gòu)自Thermo Scientific，LATaq酶、SolutionI 連接酶、T4DNA 聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、其他限制性內(nèi)切酶，購(gòu)自 Takara 公司，X-gal、dNTP、硫酸卡那霉素（kana）、氨芐青霉素購(gòu)自北京九州同業(yè)生物科技公司，壯觀霉素購(gòu)自sigma公司，PCR引物（表1）由上海捷瑞生物工程有限公司合成，Biolistic PDS-1000/He基因槍購(gòu)于Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 DNA 克隆 質(zhì)粒提取參照OMEGA bio-tek 試劑盒說明書進(jìn)行，DNA片段克隆、重組質(zhì)粒鑒定等分子克隆操作參照Sambrook提供的方法進(jìn)行[7]。

1.2.2 萊茵衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化 根據(jù)文獻(xiàn)[8]描述的方法并適當(dāng)調(diào)整后，通過基因槍法將基因?qū)肴~綠體，即3μg載體質(zhì)粒pTBNK-EGFP（1μg/μl）和2μg 抗性質(zhì)粒p228（1 μg/μl）包被50μl（60 mg/mL）直徑為0.6μm金粉子彈，按壓力1100psi、真空度28英寸汞柱、目標(biāo)距離6cm轟擊衣藻，將轟擊后的衣藻在TAP平板上暗培養(yǎng)15～20h后刮下，涂布于5皿含100μg/mL壯觀霉素抗性TAP平板，培養(yǎng)兩周。

1.2.3 葉綠體總DNA提取 衣藻葉綠體總DNA的抽提采用CTAB法[9]。

1.2.4 萊茵衣藻的培養(yǎng) 將萊茵衣藻培養(yǎng)在TAP 液體培養(yǎng)基或含1%瓊脂糖的固體平板上，在22℃～24℃、連續(xù)光照（約100 μE/m2.sec-1）條件下培養(yǎng)[10]。

2 結(jié)果

2.1 衣藻葉綠體表達(dá)載體pTBNK的構(gòu)建

以質(zhì)粒pCX16為模板，P1和P2為引物，LATaq酶PCR擴(kuò)增5.7kb 同源臂上的2.0 kb 片段，回收PCR 產(chǎn)物后，用BamHI和SphI雙酶切并回收該2.0 kb片段，然后將酶切的片段插入pCX16 載體的BamHI 和SphI 酶切位點(diǎn)間，在pCX16 載體上引入NotI 酶切位點(diǎn)得到載體pCXN；EcoRI和SphI 雙酶切載體pCXN，回收pCXN 載體骨架5.7 kb 片段，并用T4DNA 聚合酶補(bǔ)平末端，將末端補(bǔ)平片段插入pT-BASIC 的EcoRV 酶切位點(diǎn)得到載體pTBN；以質(zhì)粒pShuttle 為模板、P3 和 P4 為引物，LATaq酶 PCR 擴(kuò)增 1.2 kb kana 抗性基因片段，將該片段回收后，BglⅡ和HindⅢ雙酶切該片段，然后將酶切后的片段插入pCX13 載體的BglⅡ和HindⅢ酶切位點(diǎn)間獲得載體pCX13-kana；用BamHI 將 pCX13-kana 載體上 5’UTR-BfuI-kana-BfuILacO 部分序列-3’UTR 表達(dá)盒酶切下，T4 DNA 聚合酶補(bǔ)平末端，然后和NotI 酶切、T4DNA 聚合酶補(bǔ)平末端的pTBN 載體片段用SolutionI 連接酶進(jìn)行連結(jié)，獲得衣藻葉綠體定向表達(dá)T載體pTBNK（圖1）。

2.2 一步克隆構(gòu)建衣藻葉綠體表達(dá)載體pTBNK-EGFP

以 pFAST-EGFP 為模板，P5 和 P6 為引物，LAtaqPCR擴(kuò)增 EGFP 基因并回收該產(chǎn)物，BfuI 酶切 pTBNK 載體，連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10β 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素（50μg/ml）和X-gal（30μg/ml）的LB固體平板上，避光培養(yǎng)12～14h 后觀察，挑顯藍(lán)色的菌落（圖2）進(jìn)行PCR鑒定（圖3）。經(jīng)鑒定，陽性克隆達(dá)100%，表明重組衣藻表達(dá)載體pTBNK-EGFP構(gòu)建成功。

2.3 表達(dá)載體pTBNK-EGFP導(dǎo)入衣藻葉綠體

pTBNK-EGFP 經(jīng)基因槍法轉(zhuǎn)化萊茵衣藻葉綠體后，經(jīng)100μg/mL壯觀霉素抗性篩選，共長(zhǎng)出4個(gè)綠色單藻落，抽提野生型的葉綠體總DNA和第八次傳代的轉(zhuǎn)基因衣藻的葉綠體總 DNA 作為模板，以 P5 和 P6 為引物，PCR 擴(kuò)增EGFP片段，結(jié)果顯示四個(gè)轉(zhuǎn)基因衣藻DNA樣本中均可以擴(kuò)增出目的條帶而野生型DNA樣本無法成功擴(kuò)增目的條帶（圖4），表明EGFP成功插入萊茵衣藻葉綠體。

3 討論

我們?cè)O(shè)計(jì)在載體克隆位點(diǎn)引入BfuI 酶切位點(diǎn)，該酶的特點(diǎn)是特異性識(shí)別5’-gtatcc-3’序列，并在該序列下游任意6 個(gè)堿基處對(duì)DNA 進(jìn)行切割，切割后形成粘性末端“T”，而LAtaqDNA 聚合酶擴(kuò)增的目的片段帶“A”尾。這樣，可通過TA克隆將目的片段克隆到pTBNK。

基于LacO重構(gòu)原理[11]，在PCR 擴(kuò)增目的片段的下游引物5’增加7bp的部分LacO序列（5’-CACAATT-3’），載體骨架上攜帶 13bp 的部分LacO序列（3’-AATTGTGAGCGCT-5’），載體片段和目的片段連接后，轉(zhuǎn)化到lac+的菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含X-gal的平板，完整的LacO序列會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性的吸附宿主菌表達(dá)的LacI 蛋白，使宿主菌的乳糖啟動(dòng)子控制的β-半乳糖苷酶基因表達(dá)解抑制，表達(dá)β-半乳糖苷酶，分解X-gal使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。因此，只有目的基因閱讀框正確插入克隆位點(diǎn)組成完整LacO序列才會(huì)使菌落顯藍(lán)色，而基因閱讀框反向插入或空載體，菌落均呈白色。統(tǒng)計(jì)顯示，EGFP基因克隆至該載體并轉(zhuǎn)化后，藍(lán)色菌落占總菌落數(shù)的50%～60%，而且藍(lán)色菌落均為閱讀框正確插入的重組子（圖3）。

圖1 衣藻葉綠體定向表達(dá)T載體構(gòu)建流程圖

圖2 藍(lán)白斑篩選重組子平板

圖3 1:DNAmmaakkeerr 2Kpluuss IIII；2～2200：藍(lán)斑菌落PPCCRR擴(kuò)增EEGGFFPP基因；2211～2255：白斑菌落PPCCRR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建衣藻葉綠體表達(dá)載體pTBNK，克隆效率高、篩選方法簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低，而且不受酶切位點(diǎn)的影響，具備通用性，且重組子可通過藍(lán)白班篩選，優(yōu)于傳統(tǒng)的兩步法酶切構(gòu)建表達(dá)載體[7,11]。遺憾的是，本實(shí)驗(yàn)中EGFP未表達(dá)。盡管如此，該構(gòu)建方法極大簡(jiǎn)化外源基因插入萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體的步驟，載體構(gòu)建思路也可能適用于其他葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建。

圖4 1:DNAmmaakkeerr 2Kpluuss IIII；2～5：轉(zhuǎn)基因衣藻抽提總DDNNAA作為模板PPCCRR 擴(kuò)增EEGGFFPP 基因；6：野生型衣藻抽提總DDNNAA 作為模板PPCCRR擴(kuò)增EEGGFFPP基因