湯小朋 劉旭光 方熱軍

(1.貴州師范大學喀斯特研究院，貴州省喀斯特山地與生態(tài)環(huán)境國家重點實驗室培育基地，貴陽 550001；2.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長沙 410128)

仔豬早期斷奶可最大限度發(fā)揮母豬的繁殖性能，提高母豬年產(chǎn)仔數(shù)，對提高養(yǎng)豬生產(chǎn)經(jīng)濟效益具有重要意義[1]。但是，早期斷奶可能會因為飲食及環(huán)境的改變引發(fā)仔豬斷奶應激反應。腸道是動物響應應激反應的重要器官，當仔豬發(fā)生斷奶應激時，腸道內(nèi)環(huán)境易受大腸桿菌等病原微生物的侵襲[2]，刺激腸黏膜分泌炎性因子，破壞腸道黏膜屏障功能[3-4]，導致仔豬采食量下降，日增重降低，免疫力下降，腸道菌群失衡，甚至引起仔豬死亡[5-6]，給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來較大經(jīng)濟損失。在限抗、禁抗大背景下，通過營養(yǎng)手段改善斷奶仔豬腸道健康狀況，對提高養(yǎng)豬生產(chǎn)的經(jīng)濟效益具有重要意義。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)屬于促生長因子家族成員，是一種含有53個氨基酸殘基、3個二硫鍵的小分子肽，具有促進腸上皮細胞增殖與分化的功能，可促進幼齡動物腸道發(fā)育及營養(yǎng)物質(zhì)吸收，加速受損腸道修復進程[7-10]。EGF對熱和酸具有較強耐受性，能抵抗胰蛋白酶、糜蛋白酶及胃蛋白酶的消化。仔豬采食EGF后，通過胃后部分EGF被降解，但殘留的EGF在仔豬腸道仍能發(fā)揮生物活性[11]。EGF的這些特性使其可作為飼料添加劑直接應用于仔豬飼糧中。研究表明，EGF對斷奶仔豬腸道發(fā)育及受損腸道修復具有良好的促進作用，可有效緩解斷奶應激對仔豬生長的抑制作用[12-14]。本文綜述了EGF對仔豬斷奶腸道健康的影響及其調(diào)控斷奶仔豬腸道健康的作用機制，以期為EGF在仔豬生產(chǎn)中的應用提供理論支撐。

1 EGF對斷奶仔豬腸道發(fā)育的影響

養(yǎng)豬就是養(yǎng)腸道，仔豬的健康狀況很大程度上取決于腸道健康狀況。仔豬胃腸道功能發(fā)育尚不完善，斷奶后會因飲食及環(huán)境的改變引發(fā)斷奶應激，導致腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，影響腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收，不利于仔豬健康生長[5-6]。EGF是一種有絲分裂原，具有促進細胞增殖與分化的功能，對幼齡動物胃腸道發(fā)育具有重要作用[15]。Kang等[16]利用乳酸菌表達豬源EGF并飼喂21日齡斷奶仔豬，發(fā)現(xiàn)EGF可促進斷奶仔豬腸上皮細胞增殖，并提高小腸絨毛高度及小腸長度。Wang等[17-18]研究表明，EGF可促進斷奶仔豬十二指腸、空腸、回腸發(fā)育，提高其絨毛高度，降低隱窩深度，并促進腸上皮細胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成。Bedford等[19]研究表明，EGF可促進空腸發(fā)育，提高腸道絨毛高度，降低隱窩深度，并促進腸道杯狀細胞增殖分化。Wang等[20-21]研究表明，EGF對斷奶仔豬腸道發(fā)育具有促進作用，可有效提高斷奶仔豬小腸絨毛高度，促進腸道上皮細胞增殖，并促進哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyoin，mTOR)表達及磷酸化，說明EGF可通過激活mTOR信號通路促進斷奶仔豬腸道發(fā)育。湯小朋[22]利用脂多糖(LPS)構(gòu)建仔豬腸道損傷模型研究EGF對LPS刺激的仔豬腸道損傷的修復作用，結(jié)果表明EGF對LPS導致的腸絨毛結(jié)構(gòu)損傷具有良好的修復作用，可有效提高LPS刺激的仔豬小腸(十二指腸、空腸及回腸)絨毛高度并降低隱窩深度。以上研究表明，EGF對斷奶仔豬腸道發(fā)育具有良好的促進作用，并對受損腸道具有良好的修復功能。

腸道完整性是仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的結(jié)構(gòu)基礎，也是斷奶仔豬健康生長的前提。EGF在促進腸道發(fā)育的前提下可促進胃腸道消化酶的分泌及營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體蛋白的表達。如Lee等[23]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼喂含1.5 mg/kg EGF的飼糧可顯著增加空腸堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)及乳糖酶的活性。Bedford等[19,24]研究表明，EGF可促進斷奶仔豬腸道鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白1(sodium/glucose cotransporter 1，SGLT1)的表達及蔗糖酶分泌。Wang等[12]、Xu等[14]利用乳酸菌構(gòu)建豬源EGF表達模型，并用于仔豬飼糧中，發(fā)現(xiàn)EGF可促進腸道消化酶蔗糖酶、氨基肽酶A(aminopeptidase A，APA)、氨基肽酶N(aminopeptide N，APN)、二肽酶活性及營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白1(SGLT1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(glucose transporter 2，GLUT2)及小腸肽轉(zhuǎn)運載體1(peptide transporter 1，PEPT1)基因表達。Wang等[20]研究表明，EGF可促進腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(Slc2a2)及溶質(zhì)載體家族6(中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白6)成員19(Slc6a19)基因及SGLT1、PEPT1蛋白表達，并促進營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。利用Ussingchamber系統(tǒng)在豬小腸上皮細胞(IPEC-J2細胞)中的研究表明EGF可促進細胞對谷氨酰胺的吸收[25]。正常情況下EGF對腸道磷的吸收起抑制作用[8,26-27]，但在應激狀態(tài)下EGF可通過上調(diào)鈉磷轉(zhuǎn)運載體蛋白Ⅱb型(sodium dependent phosphate cotransporter type Ⅱb，NaPi-Ⅱb)促進斷奶仔豬對磷的吸收[28]，但這種調(diào)節(jié)機制有待進一步研究。研究還表明，EGF對Na+[29]、Cl-[30]、Mg2+[31]、5-羥色胺(serotonin,5-HT)[32]等營養(yǎng)物質(zhì)吸收具有調(diào)控作用，但是否對斷奶仔豬起作用，尚未見研究報道。綜上所述，EGF可通過促進斷奶仔豬腸上皮細胞增殖與分化、腸道絨毛發(fā)育、胃腸道消化酶的分泌、營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，從而提高仔豬生長性能。

2 EGF對斷奶仔豬腸道屏障功能的影響

腸道不僅是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要部位，也是機體防御外界刺激的重要屏障。仔豬斷奶可能會因為飲食及環(huán)境的改變而發(fā)生斷奶應激，破壞仔豬腸道屏障功能，影響動物腸道健康。EGF是一種腸道營養(yǎng)因子，對腸道機械(物理)屏障、化學屏障、免疫屏障與微生物屏障功都具有良好的調(diào)節(jié)作用[12,18-19,33-34]。

2.1 EGF促進緊密連接蛋白相關(guān)基因表達

腸上皮是由單層腸上皮細胞增殖與分化而來，將腸黏膜與腸腔分離開來。緊密連接是腸黏膜機械屏障中最重要的結(jié)構(gòu)，主要由閉合蛋白(claudins)、閉鎖蛋白(occludin)及連接黏附分子(junctional adhesion molecule，JAM)等組成，并與閉合小環(huán)蛋白(zona occludens，ZO)-1、ZO-2、ZO-3等支架蛋白相互作用形成腸道物理屏障[9]。前人研究表明，EGF可通過促進緊密連接蛋白相關(guān)基因表達，調(diào)節(jié)動物腸道屏障功能[33-34]。Geng等[34]用腸缺血再灌注損傷大鼠試驗發(fā)現(xiàn)，注射EGF可上調(diào)腸道緊密連接蛋白ZO-1及occludin的表達。Clark等[35]以壞死性腸炎(NEC)損傷大鼠模型進行試驗，結(jié)果表明EGF可通過調(diào)節(jié)腸道occludin和claudin-3的表達來緩減大鼠NEC損傷。人Caco-2細胞試驗表明，EGF可增強肌動蛋白細胞骨架的穩(wěn)定性，上調(diào)纖維形肌動蛋白(F-actin)表達，下調(diào)球形肌動蛋白(G-actin)表達[36-37]，降低細胞通透性、酪氨酸磷酸化和蘇氨酸去磷酸化作用，減弱occludin及ZO-1在細胞連接處的重新分配，維持細胞物理屏障功能[33,38-40]。Kaur等[41]用艱難梭菌(C.difficile)感染小鼠，發(fā)現(xiàn)C.difficile可導致小鼠腸道的緊密連接蛋白表達紊亂，而EGF作用后可促進腸道緊密連接表達，恢復腸道屏障功能。劉淑杰等[10]利用葡聚糖硫酸鈉構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)EGF可通過提高腸道occludin的表達修復小鼠受損的腸道組織，維持腸道黏膜屏障的完整性。

斷奶應激會破壞仔豬腸道屏障功能，導致仔豬抵御病原微生物能力下降，造成營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收障礙，引起仔豬腹瀉等腸道疾病的發(fā)生，并最終造成仔豬生長性能下降[5-6,24]。在斷奶仔豬上的研究表明，EGF可促進斷奶仔豬腸道緊密連接蛋白相關(guān)基因表達，維持仔豬腸道屏障功能[14,22]。如Xu等[14]研究表明，仔豬攝取一定量的EGF可促進空腸緊密連接蛋白ZO-1、claudin-1和occludinmRNA的表達。湯小朋[22]研究發(fā)現(xiàn)，EGF對LPS刺激導致的緊密連接紊亂具有調(diào)節(jié)作用，可促進仔豬空腸及回腸ZO-1、claudin-1和occludinmRNA的表達。但是，目前關(guān)于EGF對斷奶仔豬腸道物理屏障功能的作用機制研究尚不夠深入，對EGF調(diào)控斷奶仔豬腸道緊密連接蛋白相關(guān)基因表達的機制需進一步試驗研究。

2.2 EGF促進斷奶仔豬腸道黏蛋白2(Muc2)分泌

黏液層是保護腸道上皮細胞免受病原微生物侵害的第1道防線，對維持腸道內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡具有重要作用。黏蛋白(Mucs)是黏液的主要構(gòu)成部分，Mucs的分泌對腸道屏障功能的維持具有重要意義。研究表明EGF對Mucs的分泌具有促進作用[19,35]。Clark等[35]研究表明，EGF可通過調(diào)節(jié)腸道Muc2的分泌來減緩大鼠NEC損傷。人Caco-2細胞試驗表明，EGF可通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2-蛋白激酶C(ERK1/2-PKC)信號通路，調(diào)節(jié)細胞雙重氧化酶2(dual oxidases 2, DUOX2)的分泌，促進黏蛋白5AC(Muc5AC)及黏蛋白3(Muc3)的分泌來增強腸上皮細胞化學屏障功能，阻止病原體的侵襲[42]。斷奶仔豬上的研究表明，EGF主要通過促進腸道Muc2的分泌來維持腸道化學屏障功能[18,22,43]。Muc2是腸道中主要的分泌型黏蛋白，主要由腸道杯狀細胞分泌產(chǎn)生[9,44]。Bedford等[19]研究表明，EGF可促進腸道杯狀細胞的分化，從而促進腸道Muc2的分泌，維持黏液的更新?lián)Q代。湯小朋[22]研究表明，EGF可促進斷奶仔豬空腸及回腸Muc2 mRNA的表達，且對LPS導致的受損腸道的Muc2 mRNA表達也具有促進作用。Wang等[43]研究同樣表明，EGF可促進斷奶仔豬腸道Muc2 mRNA表達。以上結(jié)果表明，EGF可通過促進腸道化學屏障功能維持斷奶仔豬腸道屏障功能完整性。

2.3 EGF增強斷奶仔豬腸道免疫功能

腸黏膜免疫屏障是動物抵抗外界病原體入侵機體的重要屏障，主要由派伊氏結(jié)、黏膜淋巴集合體、彌散黏膜淋巴組織、免疫細胞、免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)及細胞因子(抗炎細胞因子、促炎細胞因子)組成。研究表明，EGF可促進斷奶仔豬免疫功能的發(fā)育，提高腸黏膜免疫屏障功能，減少病原體侵襲的發(fā)生[18-19,45]。Wang等[18]研究表明，EGF可促進斷奶仔豬十二指腸IgA、IgM、IgG水平。Bedford等[19]研究表明，EGF可促進斷奶仔豬腸道抗炎細胞因子白細胞介素-13(interleukin 13，IL-13)的分泌。湯小朋[22]體內(nèi)外研究表明，EGF可降低IPEC-J2細胞及斷奶仔豬空腸及回腸促炎因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA表達。Lee等[45]研究表明，EGF可促進仔豬斷奶后28 d空腸黏膜IgA水平。以上研究表明，EGF可通過提高斷奶仔豬腸道免疫球蛋白水平，促進抗炎因子分泌，抑制促炎因子分泌來提高仔豬免疫屏障功能。

2.4 EGF促進有益菌定植

腸道正常微生物菌群在維持腸道屏障功能中發(fā)揮著重要作用。益生菌可通過競爭性黏附腸道上皮細胞結(jié)合位點減少病原菌的黏附。EGF可促進有益菌定植，抑制有害菌定植[12,22,46]。如Wang等[12]研究表明，EGF可降低斷奶仔豬回腸中有害微生物大腸桿菌(E.coli)及腸球菌的數(shù)量，增加回腸及盲腸中有益微生物乳酸菌的數(shù)量，使仔豬腸道處于一個健康狀態(tài)。湯小朋[22]研究表明，EGF可抑制斷奶仔豬空腸有害菌沙門氏菌的繁殖，從而維護動物腸道健康。動物腸道共生著數(shù)以億計的微生物，與宿主協(xié)同進化，構(gòu)成一個動態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)，共同維護動物腸道屏障功能[47]。腸道微生物可通過自身或自身所產(chǎn)生的代謝物參與腸黏膜中免疫細胞的增殖和分化，從而實現(xiàn)對腸黏膜免疫系統(tǒng)的調(diào)控[48-49]。如脆弱擬桿菌可通過多聚糖A誘導調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)發(fā)育[50]，可通過促進白細胞介素-17(IL-17)的生成，進而促進輔助性T細胞的增殖[51]。EGF對腸道微生物及免疫功能均具有調(diào)節(jié)作用，但EGF是否通過微生物的調(diào)節(jié)來調(diào)控斷奶仔豬腸道免疫功能，尚需進一步研究，這也是今后研究的重要方向。綜上所述，EGF可通過調(diào)節(jié)斷奶仔豬腸道機械(物理)屏障、化學屏障、免疫屏障與微生物屏障來維持斷奶仔豬腸道健康(圖1)。

ZO-1：閉合小環(huán)蛋白zona occluden-1；occludin：閉鎖蛋白；claudins：閉合蛋白；IL-13：白細胞介素-13 interleukin-13；IgA：免疫球蛋白A immunoglobulin A；IgG：免疫球蛋白G immunoglobulin G；IgM：免疫球蛋白M immunoglobulin M；IL-1β：白細胞介素-1β interleukin-1β；IL-6：白細胞介素-6 interleukin-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；Muc2：黏蛋白2 Mucin 2。

3 EGF對斷奶仔豬腸道抗氧化功能的影響

斷奶對仔豬是一種應激反應，不僅破壞腸道黏膜屏障功能[3-4]，還會破壞機體氧化-抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡，誘導氧化應激反應[3,52]。氧化應激與動物腸道損傷密切相關(guān)[53]。機體在正常的新陳代謝過程中會不斷地生成活性氧(ROS)，并與機體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)保持良好的動態(tài)平衡，而當機體產(chǎn)生的ROS水平高于機體清除能力時，就會誘發(fā)氧化應激，導致氧化損傷，誘導細胞凋亡，破壞腸道屏障功能[3,54]。斷奶應激是養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在且不可避免的應激現(xiàn)象，對養(yǎng)豬生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響。Yin等[3]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后1 d，血清中蛋白質(zhì)氧化損傷標志物蛋白羥基(protein carbonyl，PCO)顯著含量，斷奶后3 d血清中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量顯著上升，說明斷奶誘導了仔豬氧化應激的發(fā)生。腸道是響應氧化應激反應的重要器官。Cao等[55]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后，空腸MDA含量顯著提高，抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶-1(GPX-1)、谷胱甘肽過氧化物酶-4(GPX-4)，銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因表達顯著下調(diào)，說明斷奶誘導了仔豬氧化應激的發(fā)生。因此，通過營養(yǎng)手段緩解斷奶應激造成的仔豬氧化損傷對提高仔豬生產(chǎn)效率具有重要意義。研究表明通過營養(yǎng)手段，如飼糧中添加谷氨酰胺[56]、褐藻寡糖[57]等功能性添加劑可增強仔豬機體抗氧化功能，并顯著緩解斷奶誘導的氧化應激反應。EGF是一種重要的細胞保護小肽，具有一定的抗氧化功能，對小腸缺血-再灌注誘導的氧化損傷具有緩解作用[58]。Tang等[7]在IPEC-J2細胞中的研究表明，LPS刺激可誘導IPEC-J2細胞氧化損傷的發(fā)生，氧化應激進一步加速了細胞凋亡，而EGF可通過激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)進而介導抗氧化酶基因，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和Ⅱ相代謝酶基因，如血紅素氧化酶-1(heme oxygenase，HO-1)、醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase，NQO1)的表達來緩解豬小腸上皮細胞氧化損傷，并通過線粒體途徑——B細胞淋巴瘤-2/半胱天冬酶-9(Bcl2/caspase 9)及死亡受體途徑——死亡因子受體/半胱天冬酶8(Fas/caspase 8)來降低氧化應激誘導的IPEC-J2細胞凋亡。因此，推測EGF對斷奶仔豬氧化應激也具有緩解作用，可通過緩解腸道氧化損傷，促進斷奶仔豬腸道健康，但這需要試驗進一步證實。

4 小 結(jié)

EGF是一種重要的腸道調(diào)節(jié)劑，對維持動物腸道健康有著至關(guān)重要的作用。EGF對斷奶仔豬腸道健康具有良好的調(diào)節(jié)作用，其調(diào)控仔豬腸道健康的可能機制為：1)通過調(diào)節(jié)仔豬腸道發(fā)育，促進腸道消化酶活性分泌及營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體的表達，促進仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收率，降低腹瀉率，提高生長性能。2)通過提高斷奶仔豬腸道屏障功能(促進緊密連接蛋白表達，促進黏蛋白分泌，促進免疫球蛋白及抗炎細胞因子分泌，減少促炎細胞因子分泌，提高有益菌的定植，減少有害微生物定植)，維持斷奶仔豬腸道完整性。3)還可能通過緩解腸道氧化損傷，進而改善仔豬腸道健康狀況。