童津津 張 華 熊本海 蔣林樹*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

動(dòng)物機(jī)體各個(gè)部位存在各種共生細(xì)菌，條件致病菌、致病微生物與宿主之間形成相互依存，相互作用，維持穩(wěn)定且營(yíng)養(yǎng)豐富的生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡。有些微生物共生體(微生物組)的共有基因組為宿主動(dòng)物提供了多種優(yōu)勢(shì)，例如不同結(jié)構(gòu)的碳水化合物的消化吸收與代謝、維生素的生物合成以及對(duì)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用等。

奶牛乳腺內(nèi)環(huán)境中，以傳統(tǒng)宿主-病原體相互作用的角度看待乳腺與微生物之間的關(guān)系，即當(dāng)病原微生物的感染或環(huán)境性病原菌侵入時(shí)，導(dǎo)致乳腺防御能力下降，引起乳腺組織炎性反應(yīng)及乳成分的改變，造成嚴(yán)重危害。據(jù)報(bào)道，引起奶牛乳房炎的病原菌有150多種，主要包含細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等。其中細(xì)菌為主要的致病菌，例如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌占所有病原菌的83.74%[1-2]。然而，近年來隨著宏基因組學(xué)的快速發(fā)展與廣泛應(yīng)用，越來越多的研究表明，臨床上健康的乳腺分泌物也可以包含各種細(xì)菌群基因組的標(biāo)記物，且其中絕大多數(shù)與乳腺炎無關(guān)[3]。因此，“乳腺共生微生物”的概念運(yùn)用而生，其生態(tài)特性對(duì)于更好地了解乳腺炎的發(fā)病機(jī)理可能具有重要意義，為治療和預(yù)防乳腺炎提供了新的視角與機(jī)遇。

目前研究結(jié)果表明，最佳的乳腺菌群多樣性與免疫穩(wěn)態(tài)有關(guān)，而乳腺炎或患有乳腺炎病史的微生物菌群多樣性顯著減少[4-6]。那么，乳房微生物群多樣性的破壞(生物代謝)是否具有決定乳腺炎易感性的作用尚不清楚。而且，關(guān)于各種生物和非生物因子對(duì)乳房?jī)?nèi)微生物菌落多樣性形成的作用研究較少。因此，本文旨在綜述目前關(guān)于乳房各個(gè)生態(tài)部位中微生物菌群的研究進(jìn)展，并強(qiáng)調(diào)了微生物群落代謝網(wǎng)絡(luò)特點(diǎn)及高度動(dòng)態(tài)的微生物生態(tài)系統(tǒng)研究方向，并對(duì)乳腺抗菌方面的應(yīng)用潛力及開發(fā)進(jìn)行了展望。

1 乳頭部菌群

奶牛乳頭和乳池在泌乳活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用，具有排出和儲(chǔ)存乳汁的作用。乳頭管作為預(yù)防病原菌侵襲的第1道防線，內(nèi)襯有角質(zhì)蛋白，不但封閉管道，還可有效抑制細(xì)菌和病原菌的生長(zhǎng)；此外，乳頭管底部，靠近乳頭乳池處，含有特殊的生理結(jié)構(gòu)——弗斯登堡靜脈環(huán)(圖1)，可有效抵御外來病原菌的侵襲以及防止乳汁的溢出[7]。其次，乳頭作為病原菌入侵的重要窗口，其生理結(jié)構(gòu)是防止乳房炎的有效結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和DNA提取等方法，奶牛乳頭細(xì)菌群落具有較高的微生物多樣性[8]，作為共生菌群，主要包括病原體及與皮膚相關(guān)的條件致病菌；在門水平上的細(xì)菌主要包括放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形桿菌門(Proteobacteria)，可以留在奶牛乳頭的皮膚上；在屬水平上的細(xì)菌主要包括不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、氣球菌屬(Aerococcus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、法克菌屬(Facklamia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)等。曾學(xué)琴[9]等通過對(duì)乳房炎奶牛乳頭和乳汁中微生物群落多樣性分析，結(jié)果表明，在門水平上乳頭豐度最高的是細(xì)菌厚壁菌門，而乳汁中豐度最高的細(xì)菌是變形菌門；且患有乳房炎奶牛的乳頭樣品均含有擬桿菌門細(xì)菌，而乳汁中幾乎沒有，但梭桿菌門細(xì)菌僅存在于乳頭中。因此，奶牛乳頭的菌落結(jié)構(gòu)與乳房炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

圖1 奶牛乳腺乳區(qū)解剖示意圖

長(zhǎng)期以來，乳頭端過度角化病一直被認(rèn)為是發(fā)展臨床型乳房炎的潛在危險(xiǎn)因素之一[11]。過度角化是指乳頭末端的角質(zhì)層(即角蛋白襯里)的厚度增加，通常是由于長(zhǎng)期刺激(例如，由于擠奶習(xí)慣造成的創(chuàng)傷)而引起的。多項(xiàng)研究表明，乳頭過度角化病與較高的微生物負(fù)荷和隱性乳房炎的發(fā)生呈正相關(guān)[12-13]。Derakhshani等[14]評(píng)估奶牛的生理狀態(tài)和乳頭過度角化對(duì)乳頭管和乳汁中微生物群特征的影響，結(jié)果表明，乳頭過度角化病與乳房任一部位的微生物群總體多樣性之間沒有很強(qiáng)的相關(guān)性，然而鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)除外，乳頭過度角化病與Sphingobacterium豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而Sphingobacterium是進(jìn)一步與臨床型乳房炎的潛在發(fā)病率相關(guān)的細(xì)菌屬。因此，乳頭的過度角化嚴(yán)重危害了乳頭管的完整性，并通過機(jī)會(huì)型或者致病型細(xì)菌群抑制乳腺內(nèi)細(xì)菌的定植能力。

此外，環(huán)境性病原菌也是影響乳腺健康的主要外源性致病菌，經(jīng)乳頭感染而引起奶牛的乳房炎。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌、變形桿菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌等為主要的環(huán)境性病原體[15]。據(jù)報(bào)道，不動(dòng)桿菌、氣球菌和棒狀桿菌是奶牛乳頭頂端皮膚上最常見的菌屬[16]，而環(huán)境中的不動(dòng)桿菌和氣球菌是人類皮膚的正常定居者[17]，但是它們是否與奶牛乳房健康和隱性乳房炎相關(guān)尚未見報(bào)道。

2 乳頭管部菌群結(jié)構(gòu)

奶牛的乳頭管長(zhǎng)0.65～1.30 cm，一端與乳頭乳池相連，另一端開口于乳頭頂端的乳頭孔；乳頭管的大小和括約肌的緊縮度與奶牛泌乳速度密切相關(guān)[18]。乳頭管由于其復(fù)雜的生化和結(jié)構(gòu)特性，可以有效阻止環(huán)境微生物進(jìn)入乳腺。但是，如果乳頭管的角蛋白塞部分丟失或擠奶后乳頭管的括約肌擴(kuò)張，則會(huì)損害乳房的第1道防御屏障，并通過多種來自乳房外部環(huán)境中的微生物，增加奶牛對(duì)乳腺炎的易感性[19]。致病菌破壞了乳頭管并進(jìn)入乳房的乳頭池，大多數(shù)乳腺炎病原體能夠以相對(duì)較快的速度在乳房?jī)?nèi)生態(tài)系統(tǒng)中生存和增殖，并引發(fā)不同程度的炎癥反應(yīng)[20]。

目前，由于在牛場(chǎng)擠奶廳條件下，對(duì)乳頭管進(jìn)行無菌采樣比較困難，只有少數(shù)研究報(bào)道了該部位的微生物群落多樣性[21]。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌屬是乳頭管菌群中最常見的定居者，即使在擠奶前后對(duì)乳頭消毒后也是如此[22]。此外，一些與腸道相關(guān)的細(xì)菌，如梭菌科(Clostridiaceae)和鞭毛藻科(Lachnospiraceae)，也被認(rèn)為是乳頭管中微生物群的主要成員。Falentin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，健康母牛的乳頭管和乳池中的Corynebacterium、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、Aerococcus、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和Facklamia是常見的微生物群。有研究報(bào)道，將患有臨床型乳腺炎病史的奶牛乳頭管的菌群結(jié)構(gòu)與健康奶牛相比，臨床型乳腺炎病史的奶牛乳頭管含有更高比例的細(xì)菌[14]。梭狀芽胞桿菌屬(Clostridia)和Bifidobacterium在健康乳區(qū)的比例較高，因此，桿菌與梭狀芽胞桿菌的比例在判定乳房健康中起重要作用。據(jù)報(bào)道，從牛奶或乳頭管中分離出的乳酸菌可以黏附并內(nèi)化奶牛乳腺上皮細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[23]，有助于充分認(rèn)識(shí)乳腺免疫防御機(jī)制，對(duì)預(yù)防與治療奶牛乳腺炎具有重要的意義。

因此，乳頭和乳頭管等部位定居的微生物群落組成和功能直接影響著乳房?jī)?nèi)微生物的結(jié)構(gòu)組成，與乳房的健康密不可分。大量研究結(jié)果表明，某些金黃色葡萄球菌物種在乳頭管的微生物定植可為研發(fā)治療乳房炎的藥物提供重要的依據(jù)[24-26]。此外，通過對(duì)乳汁、乳頭皮膚、糞便和床墊材料中的微生物群落比較分析結(jié)果證實(shí)，乳頭皮膚是牛奶微生物群中最重要的來源[27]；而畜群糞便和床墊鋪料的微生物群是乳內(nèi)微生物群第二大流行來源[28]。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了乳房的各個(gè)部位，特別是乳頭皮膚和乳頭管的微生物群，以及各種環(huán)境源(如墊料和擠奶設(shè)備等)在塑造乳腺內(nèi)微生物群中的重要作用。

3 乳腺內(nèi)微生物的潛在起源與環(huán)境因素

乳腺對(duì)微生物定植的防御機(jī)制受到多種因素的調(diào)節(jié)(圖2)，包括：奶牛的基因型(特別是編碼先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)各個(gè)組成部分的基因)、母牛生理狀況的變化、不同泌乳周期的代謝狀況和飼養(yǎng)管理[29]，例如干奶期抗微生物的治療、擠奶后乳頭消毒和擠奶衛(wèi)生等[27]。上述各個(gè)因素在調(diào)節(jié)乳房的免疫穩(wěn)態(tài)和抵抗乳腺感染的過程中都起著重要的作用。因此，這些因素在對(duì)乳腺內(nèi)微生物群落的組成及功能等方面也具有直接或間接影響。

圖2 奶牛乳腺健康影響因素概圖

目前，鑒定乳腺炎易感性遺傳標(biāo)志物的主要方法是候選基因內(nèi)的遺傳變異，最重要的是對(duì)乳腺炎病原體所發(fā)生的全身和局部免疫反應(yīng)[30]，即與抗原識(shí)別后，白細(xì)胞募集和病原體消除是最重要的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。例如，由于編碼主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)分子的基因[也稱為牛白細(xì)胞抗原(BoLA)]在調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用而受到越來越多的關(guān)注[31-32]。特別是MHC基因和共生菌群之間的潛在聯(lián)系，也得到廣泛研究。研究表明，MHC基因型的多態(tài)性可以影響胃腸道上共生菌群的組成，例如某些Ⅱ類MHC基因型可以增加小鼠對(duì)沙門氏菌誘導(dǎo)的腸道感染的抵抗力[33]，但在奶牛乳腺炎中關(guān)于MHC基因與共生菌群之間的聯(lián)系研究較少。此外，在最近的一項(xiàng)研究中，BoLA DRB3.2的多態(tài)性與分娩后立即收集的初乳樣品中獨(dú)特的微生物群譜密切相關(guān)[34]，在這項(xiàng)研究中，每種已鑒定的BoLA-DRB 3.2單倍型(n=3)與初乳菌群內(nèi)特定操作分類單元的富集相關(guān)，如S.chromogenes、S.sciuri和S.succinus物質(zhì)。因此，與乳腺炎易感性密切相關(guān)的候選基因可能通過調(diào)節(jié)乳內(nèi)微生物群落，參與調(diào)節(jié)乳房穩(wěn)態(tài)以及保護(hù)乳房免受主要乳腺炎病原體的侵襲而發(fā)揮作用。

奶牛的營(yíng)養(yǎng)管理對(duì)乳房穩(wěn)態(tài)及乳腺健康具有重要的意義。例如在圍產(chǎn)期，奶牛的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和干物質(zhì)采食量(DMI)落后于機(jī)體所需的能量，負(fù)能量平衡(NEB)的這種不可避免的狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致各種新陳代謝疾病的發(fā)展，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受損[35]。機(jī)體內(nèi)非酯化脂肪酸(NEFA)和酮體濃度升高與關(guān)鍵免疫功能受損密切相關(guān)，這些免疫功能包括吞噬活動(dòng)、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活性氧(ROS)產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞的募集及其易位內(nèi)皮、炎性細(xì)胞因子的分泌、肝細(xì)胞產(chǎn)生補(bǔ)體因子和急性期蛋白、激活免疫系統(tǒng)以及分泌免疫球蛋白等。但是，目前關(guān)于圍產(chǎn)期代謝紊亂對(duì)乳房微生物群組成的潛在影響知之甚少。

此外，亞急性瘤胃酸中毒(SARA)是一種因高精料飼喂而引起的瘤胃和后腸微生物群失調(diào)所發(fā)生的代謝紊亂疾病[36]。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生SARA的初產(chǎn)奶牛泌乳初期的乳汁微生物群與病原菌和條件性致病菌[包括嗜麥芽單胞菌屬(Stenotrophomonas)、Streptococcus、假單胞菌屬(Pseudomonas)和產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)]的富集顯著相關(guān)[37]，證實(shí)全身和局部炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)是SARA調(diào)節(jié)乳房免疫穩(wěn)態(tài)的潛在機(jī)制。還有研究報(bào)道，在SARA期間，反芻動(dòng)物胃腸道中游離脂多糖(LPS，革蘭氏陰性細(xì)菌外細(xì)胞膜的免疫原性成分)的脫落和積累會(huì)觸發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[38]。那么，SARA對(duì)胃腸道上皮屏障的破壞可使得游離的LPS從腸腔轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)和淋巴系統(tǒng)，與特定的急性期蛋白結(jié)合稱為L(zhǎng)PS結(jié)合蛋白[39-40]；所得的LPS結(jié)合蛋白是一種免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，能夠從血液循環(huán)/淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到包括乳房在內(nèi)的各種身體部位，并通過激活核因子-κB(NF-κB)促炎途徑來調(diào)節(jié)局部免疫力。但是，與SARA相關(guān)的乳房微生物群組成的變化是炎癥性免疫反應(yīng)激活的結(jié)果，還是由于細(xì)菌從胃腸道轉(zhuǎn)移到乳房引起的，仍未得到答案，需要進(jìn)一步研究。

奶牛的居住條件在塑造乳房微生物群的組成中起著核心作用，而乳頭和乳頭管內(nèi)微生物群落的組成與牛場(chǎng)環(huán)境密切相關(guān)[28]。據(jù)報(bào)道，雖然擠奶前乳頭消毒不影響室內(nèi)奶牛乳汁的微生物群，但在室外放牧季節(jié)，經(jīng)過擠奶前乳頭消毒的奶牛乳汁微生物群比未處理組更為多樣化[41]。在擠奶廳收集的乳汁樣本中，牛奶菌群中與腸道相關(guān)的菌屬如Ruminococcus、Aerococcus和普雷沃菌屬(Prevotella)的比例較高；而在牧場(chǎng)收集的乳汁樣本中，革蘭氏陰性菌[如假單胞菌(Pseudomonas)]和Acinetobacter的比例較高。這些發(fā)現(xiàn)為更好地了解環(huán)境因素(尤其是牛場(chǎng)管理和擠奶衛(wèi)生)在塑造整體乳房微生物群中的作用提供了寶貴的見解。床墊管理是乳腺炎控制程序的另一個(gè)重要方面，它可能會(huì)影響奶牛環(huán)境的微生物狀況，進(jìn)而影響乳房的微生物定植；據(jù)報(bào)道，在使用稻草墊料的農(nóng)場(chǎng)中，冬季采集的牛奶和乳頭采集的棉簽樣本均比夏季采集的樣本富含物種更豐富的微生物群[42]。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了季節(jié)性因素(如環(huán)境溫度和濕度)對(duì)奶牛周圍環(huán)境微生物群組成以及乳房微生物群的潛在貢獻(xiàn)。

4 微生物菌群失調(diào)與乳房健康的潛在影響

越來越多的證據(jù)表明，臨床型乳房炎的發(fā)生與乳腺內(nèi)微生物多樣性的減少和菌群組成的改變密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，與健康奶牛相比，梭桿菌門僅在乳房炎奶牛乳頭中檢測(cè)到，而在健康奶牛乳頭中未檢測(cè)到；乳房炎奶牛乳頭Staphylococcus豐度高于正常奶牛，腸球菌屬(Enterococcus)僅在乳房炎奶牛牛奶中檢測(cè)到，正常奶牛牛奶中未檢測(cè)到[9]。而且，乳腺炎病原體通常有多種毒力因子，使它們能夠抵抗機(jī)體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)而在乳房?jī)?nèi)定植[43]。在最初的定植之后，病原體可以迅速地在乳房的生態(tài)系統(tǒng)中生長(zhǎng)并消除其常駐共生菌群。然而，在乳房生態(tài)系統(tǒng)中，致病菌的優(yōu)勢(shì)通常不會(huì)持續(xù)存在，而且由于免疫細(xì)胞的活動(dòng)和通過定期擠奶進(jìn)行的清除，或者在治療干預(yù)的幫助下(如乳腺內(nèi)注射抗菌劑)，這種優(yōu)勢(shì)通常會(huì)自行消除。因此，共生細(xì)菌的恢復(fù)程度一方面取決于用于治療乳腺炎的抗菌劑的活性，另一方面也取決于侵入性病原體的毒力因子，如生物膜的形成和內(nèi)化乳腺上皮細(xì)胞的能力等[44]。因此，充分了解乳腺微生物群落不僅能加深我們對(duì)乳房各個(gè)部位之間的生態(tài)關(guān)系的理解，而且能使我們更全面、更準(zhǔn)確地評(píng)估各種乳腺炎治療的有效性。

5 小 結(jié)

綜上所述，乳腺內(nèi)的共生菌群棲息于乳房的不同部位，包括乳頭頂端、乳導(dǎo)管和乳房?jī)?nèi)的生態(tài)系統(tǒng)，可以通過直接的微生物-微生物交互作用、間接的免疫刺激或兩者兼用來調(diào)節(jié)奶牛對(duì)乳腺炎病原體的易感性。因此，更好地了解能夠影響乳房?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定的各種因素，為開發(fā)治療奶牛乳房炎的新思路及新方法奠定基礎(chǔ)。

雖然目前對(duì)乳房的微生物生態(tài)系統(tǒng)的了解尚處于嬰兒期，但是乳房?jī)?nèi)微生物群的最佳多樣性及由1個(gè)健康的乳房組成共生菌群和機(jī)會(huì)菌群之間的平衡，對(duì)于維持促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)之間的平衡從而維持乳房?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定是至關(guān)重要的。研究奶牛的生理狀態(tài)、乳房的解剖特征、與免疫應(yīng)答相關(guān)的遺傳特性以及環(huán)境因素會(huì)改變?nèi)榉课⑸锶旱慕M成等，可以更好地了解乳房不同部位的共生菌群相互作用及與乳腺炎病原體和免疫系統(tǒng)相互作用，為更好地治療奶牛乳腺炎及相關(guān)藥物的研發(fā)提供有利保障。