宋 丹，王艷艷，張 杰，趙云清

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國(guó)其發(fā)病率居各類腫瘤的首位。胃癌不僅會(huì)造成消化系統(tǒng)損害，而且可能發(fā)生轉(zhuǎn)移，影響患者的肝腎及呼吸功能，甚至出現(xiàn)惡病質(zhì)，最終危及其生命[1]。早期胃癌預(yù)后較好，但其早期病情隱匿，故尋找有效的分子標(biāo)記物評(píng)價(jià)胃癌患者預(yù)后有重要意義。

腦選擇性蛋白激酶2(brain-selective kinase 2, BRSK2)是腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase/AMPK)家族的一員，早期認(rèn)為其主要功能是維持神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)BRSK2可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期影響細(xì)胞增殖和凋亡，并且在多種消化道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。X染色體連鎖鋅指蛋白(zinc finger protein X-linked, ZFX)位于X染色體，屬于鋅指蛋白家族，在多種肝細(xì)胞的自我更新和抗凋亡機(jī)制中發(fā)揮重要作用。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)ZFX在惡性腫瘤患者中呈高表達(dá)狀態(tài)，然而其表達(dá)與胃癌患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系尚不明確[3]。膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1, CTHRC1)是一種新發(fā)現(xiàn)的具有生物活性的基因產(chǎn)物，屬于分泌型蛋白。多項(xiàng)研究顯示，在腫瘤組織中CTHRC1可參與多種機(jī)制調(diào)節(jié)信號(hào)通路及腫瘤的形成、侵襲與轉(zhuǎn)移[4]。本研究分析了BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及與其病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2016年1月—2018年1月本院收治的58例胃癌患者的臨床資料。①納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者有明確的病理學(xué)診斷依據(jù)確診為胃癌；入組前未接受過放療及化療；臨床資料完整且真實(shí)。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并血液疾病者；無法耐受本研究檢測(cè)方法者；嚴(yán)重精神疾患或癡呆等無法配合本研究者；存在除胃癌以外其他原發(fā)惡性腫瘤者；合并風(fēng)濕免疫及結(jié)締組織病變者。男25例，女33例；年齡28～80(53.21±6.37)歲；根據(jù)病理部位不同分為胃癌組織組(腫瘤組織)和癌旁組織組(距離胃癌組織5 cm以的上正常胃黏膜組織)，每組58例。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 收集納入者的臨床資料，比較BRSK2、ZFX及CTHRC蛋白在胃癌及癌旁組織的表達(dá)情況；記錄納入者在隨訪時(shí)間內(nèi)存活及死亡情況，分析BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白與胃癌患者各病理參數(shù)的相關(guān)性，繪制Kaplan-Meier生存曲線研究BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白對(duì)患者預(yù)后的影響，并采用多元Logistic回歸分析影響胃癌患者預(yù)后生存的危險(xiǎn)因素。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1主要試劑與儀器：RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，引物購(gòu)自上海生工生物公司，兔抗人BRSK2多克隆抗體，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，ZFX單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，即用型免疫組織化學(xué)UltraSensitive TM S-P超敏試劑盒(鼠/兔)購(gòu)自福州邁新技術(shù)開發(fā)有限公司，DAB 顯色試劑盒購(gòu)置北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為illumina Ero，光學(xué)顯微鏡為日本 OLYMPUS。

1.3.2BRSK2的表達(dá)水平檢測(cè)：將所收集的組織制作成厚度4 μm的切片，放入80℃烤箱中烤片30 min后經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化；切片經(jīng)檸檬酸緩沖液煮沸法修復(fù)抗原，冷卻后用PBS緩沖液沖洗；然后用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；切片滴加兔抗人BRSK2多克隆抗體(一抗)，在4℃下孵育過夜；PBS緩沖液沖洗切片后滴加通用型IgG抗體-HPR多聚體，37℃下孵育15 min；PBS緩沖液沖洗后采用現(xiàn)配DAB試劑染色，蘇木精輕度復(fù)染細(xì)胞核沖洗脫水干燥后用中性樹膠封片，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.3ZFX的表達(dá)水平檢測(cè)：切片處理、脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)(同BRSK2的表達(dá)水平檢測(cè))后，滴加ZFX一抗，4℃孵育過夜。次日PBS緩沖液洗滌后，滴加二抗，37℃孵育30 min。最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。ZFX 陽性切片可見細(xì)胞核呈棕黃色，部分病例可見胞質(zhì)著色。

1.3.4CTHRC1的表達(dá)水平檢測(cè)：將所收集的組織制作成厚度4 μm的切片，放入60℃烤箱中烤片30 min后經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化；使用PH 6.0的檸檬酸抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，冷卻后用PBS緩沖液沖洗；然后用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；稀釋兔抗人 CTHRC1多克隆抗體，之后在載玻片加入稀釋好的CTHRC1抗體并孵育，放入4℃冰箱中過夜。于次日滴加二抗，37℃下孵育20 min。最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。

1.3.5結(jié)果判定[5]：每張組織切片在高倍鏡視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，依據(jù)切片中細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞染色范圍判定染色結(jié)果顯微鏡下雙盲法閱片，染色范圍1%～5%計(jì)為0分，6%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，51%～75%計(jì)為3分，76%～100%計(jì)為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為基本不著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；兩者相乘最終得分：0分為陰性，1～2分為弱表達(dá)，3～4分為中度表達(dá)，5～6分為強(qiáng)表達(dá)，>2分均認(rèn)定為陽性表達(dá)。

1.4隨訪 所有納入者均從術(shù)后開始隨訪，直至死亡或隨訪結(jié)束日期，為期2年，截止于2019年12月。患者的隨訪時(shí)間分布在2～24(16.71±5.93)個(gè)月。隨訪主要采用電話、微信隨訪及患者來院復(fù)查為主。在本研究總生存時(shí)間(Overall Survival, OS)表示胃癌患者從手術(shù)至死亡的時(shí)間[6]。

2 結(jié)果

2.1BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌及癌旁組織的表達(dá) BRSK2在胃癌組織中的陽性表達(dá)率低于癌旁組織(P<0.05)，ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.01)。見表1。

表1 2組BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌及癌旁組織的表達(dá)情況比較[例(%)]

2.2BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白表達(dá)情況與胃癌各病理參數(shù)的相關(guān)性 BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白表達(dá)情況與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、手術(shù)方式及組織分化程度無關(guān)(P>0.05)；與侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白表達(dá)情況與胃癌患者各病理參數(shù)的相關(guān)性(例)

2.358例胃癌預(yù)后情況 截至隨訪結(jié)束，58例胃癌死亡17例，存活41例，病死率為29.31%，存活率為70.69%。

2.4BRSK2表達(dá)與胃癌預(yù)后生存的關(guān)系 BRSK2陰性組的平均生存時(shí)間為18.61個(gè)月，BRSK2陽性組的平均生存時(shí)間為29.83個(gè)月；BRSK2陰性組平均生存時(shí)間短于BRSK2陽性組(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同BRSK2表達(dá)胃癌患者的生存情況比較

2.5ZFX表達(dá)與胃癌預(yù)后生存的關(guān)系 ZFX陰性組的平均生存時(shí)間為30.78個(gè)月，ZFX陽性組平均生存時(shí)間為15.57個(gè)月，ZFX陰性組平均生存時(shí)間長(zhǎng)于ZFX陽性組(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同ZFX表達(dá)胃癌患者的生存情況比較

2.6CTHRC1蛋白表達(dá)與胃癌預(yù)后生存的關(guān)系 CTHRC1蛋白陰性組的平均生存時(shí)間35.00個(gè)月，CTHRC1蛋白陽性組平均生存時(shí)間為15.07個(gè)月，CTHRC1蛋白陰性組平均生存時(shí)間長(zhǎng)于CTHRC1蛋白陽性組(P<0.05)。見圖3。

圖3 不同CTHRC1蛋白表達(dá)胃癌患者的生存情況比較

2.7影響胃癌預(yù)后生存的單因素和多因素分析 侵襲深度為T3+T4、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、BRSK2陰性、ZFX陽性、CTHRC1蛋白陽性為影響胃癌預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響胃癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析

3 討論

胃癌惡性程度高，早期癥狀不明顯且進(jìn)展迅速，單純地依靠臨床和病理分期對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估缺乏準(zhǔn)確性和特異性[7]。因此尋求與腫瘤生長(zhǎng)及發(fā)展有關(guān)的分子標(biāo)志物，對(duì)于腫瘤疾病的初步篩查、診斷、治療和預(yù)后判斷尤為重要。

3.1BRSK2在胃癌組織中表達(dá)水平及其與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 近年來，蛋白激酶AMPK及其家族成員與腫瘤的關(guān)系逐漸引起關(guān)注。由于腫瘤細(xì)胞常處于過度增殖狀態(tài)，其周圍血液及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)有限，導(dǎo)致腫瘤周圍微環(huán)境缺血、缺氧及低糖[8]。而作為APMK家族的重要組成部分，BRSK2能夠參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可以增強(qiáng)癌細(xì)胞抵抗糖饑餓環(huán)境的能力[9]。

Saiyin等[10]利用iRNA技術(shù)將培養(yǎng)液中的BRSK2活性抑制后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大片壞死，這一發(fā)現(xiàn)說明BRSK2可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞在缺乏能量環(huán)境中的侵襲性。本研究對(duì)58例胃癌組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示BRSK2蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，其在胃癌組織中的陽性表達(dá)率低于癌旁組織，提示BRSK2蛋白表達(dá)水平降低可反映機(jī)體癌變的發(fā)生。利用Kaplan-Meier曲線對(duì)不同BRSK2蛋白表達(dá)情況預(yù)后生存情況進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)BRSK2陰性組平均生存時(shí)間短于陽性組，這與王小強(qiáng)等[11]研究結(jié)果相似，進(jìn)一步說明BRSK2的表達(dá)水平下降是影響患者死亡的高危因素之一。

本研究結(jié)果顯示，BRSK2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤侵襲深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，侵襲深度為T3+T4、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響胃癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明BRSK2蛋白可能與腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)，提示其可作為胃癌患者一個(gè)潛在的預(yù)后分子生物學(xué)標(biāo)志物。

3.2ZFX在胃癌組織中表達(dá)水平及與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 鋅指蛋白在機(jī)體發(fā)育和分化過程中發(fā)揮著重要的生理功能，胃鋅指蛋白存在于胃壁細(xì)胞中，可調(diào)節(jié)分泌胃酸的胃壁細(xì)胞中H+/K+-ATP酶，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃功能[12]。ZFX是一種由X染色體編碼的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，屬于典型的C2H2型蛋白。2018年張雪等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)ZFX的表達(dá)降低后與肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的克隆形成、增殖、遷移、轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，推測(cè)ZFX在肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本研究結(jié)果亦顯示，ZFX在胃癌組織組陽性表達(dá)率高于癌旁組織組，提示ZFX在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著促癌基因的作用。

本研究結(jié)果顯示，ZFX蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平與患者腫瘤侵襲深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示ZFX異常表達(dá)增高與胃癌的惡性程度、疾病的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。分析其原因可能與ZFX通過修改下游某些基因的表達(dá)，如胱天蛋白1等，來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡。進(jìn)一步的Kaplan-Meier生存分析顯示，ZFX陰性組平均生存時(shí)間長(zhǎng)于陽性組，這與崔記芳等[14]研究結(jié)果相似，提示ZFX可作為評(píng)價(jià)胃癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物之一。

3.3CTHRC1在胃癌組織中表達(dá)水平及與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān) CTHRC1基因定位于人類染色體8q22.3上，而CTHRC1蛋白只在特定組織的細(xì)胞外復(fù)合物中表達(dá)，同細(xì)胞外復(fù)合物相關(guān)，并帶有一個(gè)短小的超二級(jí)膠原蛋白結(jié)構(gòu)。唐振寧等[15]發(fā)現(xiàn)CTHRC1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)異常增強(qiáng)，推測(cè)CTHRC1與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)，可能參與了甲狀腺乳頭狀癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。2019年湯月良等[16]通過采用Western blotting檢測(cè)胃癌組織、癌旁組織和胃癌細(xì)胞CTHRC1的蛋白表達(dá)水平，并采用Kaplan-Meier分析CTHRC1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CTHRC1蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，胃癌組織中CTHRC1高表達(dá)患者的5年生存率明顯低于低表達(dá)患者；本研究與其結(jié)果一致。說明CTHRC1蛋白在高表達(dá)狀態(tài)下可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，分析其原因可能與CTHRC1通過改變腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤細(xì)胞的生存環(huán)境，最終促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展有關(guān)[17]。

本研究分析了CTHRC1蛋白與胃癌各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示CTHRC1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平與患者腫瘤侵襲深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示CTHRC1蛋白陽性表達(dá)參與了胃癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。一般來說，腫瘤患者的預(yù)后與分化程度相關(guān)；在其他條件同等的前提下，分化程度低的患者較病理分級(jí)低的患者生存期短[18-20]。而TNM分期在評(píng)估預(yù)后方面有著重要的作用，胃癌患者的生存期隨著TNM分期升高而縮短，本研究結(jié)果亦顯示，侵襲深度為T3+T4、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也進(jìn)一步證實(shí)CTHRC1蛋白表達(dá)情況與胃癌的發(fā)展關(guān)系密切，可將其作為預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后的分子標(biāo)志物之一。

本研究不足之處為納入樣本量較少，導(dǎo)致抽樣誤差，結(jié)果不具有代表性；隨訪方式以電話隨訪等為主，缺乏臨床驗(yàn)證，不能確定患者死亡是否均與胃癌有關(guān)。為進(jìn)一步分析BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及與病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系，未來可擴(kuò)大樣本量，加強(qiáng)隨訪真實(shí)性。

綜上所述，BRSK2在胃癌組織中表達(dá)水平下降，ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平增高；BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白表達(dá)異常均參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展，與預(yù)后生存關(guān)系密切，可作為預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后的分子標(biāo)志物和治療的潛在靶點(diǎn)。